[发明专利]一种高稳定性重组降钙素原、制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明涉及降钙素原(Procalcitonin，PCT)高稳定性改造、密码子优化基因，其重组蛋白，还涉及该蛋白稳定性的评价及在标准品曲线绘制中的应用。

背景技术

降钙素原(Procalcitonin，PCT)是人降钙素(Calcitonin,CT)的前体物质，由116个氨基酸组成，相对分子质量13KD。PCT是甲状腺滤泡旁C细胞产生和分泌，并由细胞内特殊蛋白酶分解为有活性的降钙素。正常人血清中PCT含量很低，但在感染细菌或败血症，脓毒血症等情况是会急剧上升，同白细胞，白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，C反应蛋白(CRP)这些炎症因子相比，其灵敏度及特异性等更高。因此可根据PCT浓度作出是否存在细菌性感染的初步诊断,并选择是否使用抗生素。通常临床认为当血清中PCT>0.25ng/ml时可以使用抗生素；PCT>5ng/ml必须使用抗菌素。因此，血清中PCT水平可以作为鉴定细菌感染程度和抗生素指导使用的临床指标，在提示细菌感染及其感染程度、判断治疗效果、指导抗菌药物治疗等方面发挥了重要的作用。

目前用于PCT检测的有多种方法,如放射免疫法，酶免法，免疫化学发光法，金标法等，而这些方法必须以PCT抗原制备梯度浓度的标准品，推算样本中PCT的含量。由于PCT抗原含有降解位点，因此，常规条件下极不稳定，容易降解，极大地影响检测结果的准确性。

PCT是血清降钙素(Calcitonin,CT)无活性的前肽物质,由位于11号染色体(11p1514)上的Calc-I基因编码,通过选择性剪接(编码1～4外显子)生成Calc-ImRNA,正常条件下,PCT mRNA在甲状腺滤泡旁细胞粗面内质网内翻译成含141个氨基酸残基的前PCT,分子质量为16kD。前PCT进入内质网膜,经糖基化和特异性酶切除N-末端的信号肽,生成含116个氨基酸残基的PCT，在高尔基体中，经系列水解酶作用最终形成PCT氨基多肽(1-57aa)、降钙素(60-91aa)及降钙蛋白(96-116aa)。由此可以看出58-59aa,92-95aa分别为水解位点，这些水解酶的存在可能是导致PCT参考品的不稳定的重要因素。

本研究通过退火延伸PCR法和搭桥PCR法突变PCT中的降解位点基因,在此基础上构建原核表达系统高效表达重组基因，经层析柱纯化得到纯度较高的目的蛋白后，稳定性试验实验显示：敲除掉蛋白酶切位点的重组PCT蛋白有效解决了常用PCT抗原检测标准品中容易降解的瓶颈难题。为PCT的免疫检测提供了可靠的高稳定性的检测标准品，对于扩大PCT检测的临床应用，更好的指导抗生素用药，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种高稳定性的重组PCT抗原。本发明另一目的提供有大肠杆菌优势密码子组成的上述抗原表位基因。本发明提供了在上述基因基础获得的PCT重组抗原。本发明还提供了在上述抗原在PCT免疫检测中稳定性方面的实验结果，该抗原实现了具有较高稳定性的实验目的。

具体地，本发明提供一种高稳定性的重组PCT抗原,其特征在于:所述抗原片段为PCT氨基多肽-连接臂1-降钙素-连接臂2-降钙蛋白。所述的氨基多肽、降钙素、降钙蛋白均为PCT抗原的组成部分，其位点分别位于野生PCT抗原的1-57aa、60-91aa及96-116aa。所述连接臂1为(-Gly-Gly-)，所述连接臂2为(-Ser-Gly-Gly-Gly),所述重组降钙素原氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

更具体地，所述重组降钙素原片段用连接臂1和连接臂2替代天然PCT序列中的58-59aa，92-95aa两部分肽链。

上述的高稳定性重组PCT抗原的密码子优化基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种高稳定性重组降钙素原的制备方法，包括以下步骤：

1)设计高稳定性降钙素原氨基酸序列：采用连接臂1(-Gly-Gly-)和连接臂2(-Ser-Gly-Gly-Gly)分别替换天然降钙素原位于58-59aa水解位点(-Lys-Arg-)和位于92-95aa水解位点(-Gly-Lys-Lys-Arg-)，替换后的PCT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

2)高稳定性降钙素原基因的密码子优化及获取：采用大肠杆菌优势密码子将步骤1)中SEQ ID NO:1氨基酸序列反向翻译成核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，采用退火延伸PCR技术，获得由大肠杆菌优势密码子组成的高稳定性降钙素原基因；