[发明专利]一种重组乙酰化阳离子型胰蛋白酶的制备方法及其应用

权利要求书

1.制备胰蛋白酶的方法，包括向受体大肠杆菌细胞中导入氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的胰蛋白酶原的编码基因，得到重组大肠杆菌细胞；对所述重组大肠杆菌细胞进行诱导表达后，收集所述重组大肠杆菌细胞；破碎所述重组大肠杆菌细胞，得到包涵体；对所述包涵体进行变性，得到变性后的样品；将所述变性后的样品进行复性，得到复性后的样品；将所述复性后的样品进行第一次纯化，得到纯化后的胰蛋白酶原；将所述纯化后的胰蛋白酶原进行激活，得到激活的胰蛋白酶；将所述激活的胰蛋白酶进行第二次纯化，得到纯化后的胰蛋白酶；

所述复性在复性缓冲液中进行，所述复性缓冲液的pH值为7.0-9.0，所述复性缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、尿素、胱氨酸和半胱氨酸；所述三羟甲基氨基甲烷在所述复性缓冲液中的浓度为10-50mM，所述尿素在所述复性缓冲液中的浓度为1-2M，所述胱氨酸在所述复性缓冲液中的浓度为1-2mM，所述半胱氨酸在所述复性缓冲液中的浓度为3-5mM；

所述第一次纯化为将所述复性后的样品进行阳离子交换柱层析，收集所述胰蛋白酶原的洗脱峰；所述阳离子交换柱层析中所采用的阳离子交换基团是磺丙基，所采用的洗脱程序为NaCl线性梯度洗脱，所述NaCl线性梯度洗脱采用NaCl线性梯度洗脱液进行洗脱，所述NaCl线性梯度洗脱液的pH值为4.6，由溶剂和溶质组成，所述溶质为NaCl，所述溶剂为pH值为4.6，醋酸根离子浓度为10-50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液；所述NaCl线性梯度洗脱的时间是48min，所述NaCl线性梯度洗脱中NaCl的浓度在48min内由0.025M匀速升至0.4M；

所述激活在激活缓冲液中进行，所述激活缓冲液的pH值为7.5-8.5，所述激活缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、氯化钙和甘油；所述三羟甲基氨基甲烷在所述激活缓冲液中的浓度为10-50mM，所述氯化钠在所述激活缓冲液中的浓度为0.1-0.3M，所述氯化钙在所述激活缓冲液中的浓度为1-20mM，所述甘油在所述激活缓冲液中的体积百分比浓度为5-15％；

所述第二次纯化为将所述激活的胰蛋白酶进行凝胶过滤层析，收集所述激活的胰蛋白酶的洗脱峰；所述凝胶过滤层析所用层析介质的分离范围为10-600kD，所述凝胶过滤层析所用层析柱的柱长度和柱内径比为36：1，所述凝胶过滤层析所采用的洗脱剂是凝胶过滤层析洗脱液，所述凝胶过滤层析洗脱液的pH值为7.5-8.5，所述凝胶过滤层析洗脱液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷和氯化钙；所述三羟甲基氨基甲烷在所述凝胶过滤层析洗脱液中的浓度为10-50mM，所述氯化钙在所述凝胶过滤层析洗脱液中的浓度为1-20mM。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述胰蛋白酶原的编码基因的序列是SEQID No.1的第1-699位。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对纯化后的胰蛋白酶原进行浓缩的步骤，和/或，对激活后的胰蛋白酶进行浓缩的步骤，和/或，对纯化后的胰蛋白酶进行浓缩的步骤。

4.制备胰蛋白酶的成套试剂A，为A1或A2；所述A1由试剂1、试剂2、试剂3和试剂4组成；所述试剂1、所述试剂2、所述试剂3和所述试剂4均独立包装；所述试剂1由三羟甲基氨基甲烷、尿素、胱氨酸和半胱氨酸组成，三羟甲基氨基甲烷、尿素、胱氨酸和半胱氨酸的摩尔比为(10-50):(1000-2000):(1-2):(3-5)；所述试剂2由氯化钠、乙酸和醋酸钠组成；所述试剂3由三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、氯化钙和甘油组成，三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、氯化钙和甘油的配比为(10-50)mmol：(100-300)mmol：(1-20)mmol：(50-150)mL；所述试剂4由三羟甲基氨基甲烷和氯化钙组成，三羟甲基氨基甲烷和氯化钙的摩尔比可为(10-50)：(1-20)；

所述A2由权利要求1中所述的复性缓冲液、权利要求1中所述的NaCl线性梯度洗脱液、权利要求1中所述的激活缓冲液和权利要求1中所述的凝胶过滤层析洗脱液组成。