[发明专利]一种用于检测食品中细菌的探针、试剂盒和方法

权利要求书

1.一种用于检测食品中细菌的探针，其特征在于：所述探针呈分子信标结构，即探针序列由茎、环两部分组成，总长度25～60个碱基，其中中间的环序列部分与细菌16s rRNA或23s rRNA序列相匹配，两端茎部分是5～8个互补的DNA或PNA序列，探针在常温下会自动退火形成发夹结构；探针的5’端用荧光基团标记，3’端用荧光淬灭基团标记，常态下游离的探针由于呈发夹结构，荧光基团因紧挨荧光淬灭基团，而不会有荧光发出，只有当探针与靶序列成功杂交上之后，荧光基团和荧光淬灭基团分离开来，才会发出荧光；

所述探针是通过核酸杂交的原理检测食品中的细菌的，所述细菌包括食品中正常携带的细菌以及食品被污染后带上的致病菌。

2.根据权利要求1所述的用于检测食品中细菌的探针，其特征在于，所述探针5’端的荧光基团为FITC、FAM和Cy3中的一种，所述探针3’端的荧光淬灭基团为DABCYL、BDH和TANRA中的一种。

3.一种用于检测食品中细菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)权利要求1或2中所述的探针；

(2)重悬固定液；

(3)杂交液；

(4)洗涤液；

所述重悬固定液包括：

4.根据权利要求3所述的用于检测食品中细菌的试剂盒，其特征在于，所述杂交液包括5％(w/v)PEG，50mM NaCl，40％(v/v)甲酰胺，0.5％(w/v)过硫酸铵，1％(w/v)DEPC，1％(w/v)聚蔗糖，50mM EDTA，0.1％(v/v)TritonX-100，50mM pH 8.0的Tris-HCl；

所述洗涤液包括50mM pH 10.0的Tris-HCl，0.5M NaCl，0.1％(v/v)NP-40，0.5％(v/v)Triton X-100。

5.一种采用如权利要求3-4任一所述试剂盒的用于检测食品中细菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1a)取待检食品样品，加入到重悬固定液中，震荡混匀；

(2a)取步骤(1a)中混匀后的液体滴在载玻片上，然后烘干；

(3a)将步骤(2a)中获得的载玻片浸入甲醇中浸泡，然后烘干；

(4a)在浸泡后的载玻片上的待检位置加入杂交液和探针，置于杂交炉中避光杂交；

(5a)将步骤(4a)中获得的载玻片浸入预热的洗涤液中洗涤，然后烘干；

(6a)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用10×物镜扫视和计数，用40或100×物镜观察细菌形态；

或者所述方法包括以下步骤：

(1b)取待检食品样品，加入到重悬固定液中，震荡混匀；

(2b)过滤得到滤液；

(3b)取步骤(2b)中得到的滤液滴在载玻片上，然后烘干；

(4b)将步骤(3b)中获得的载玻片浸入甲醇中浸泡，然后烘干；

(5b)在浸泡后的载玻片上的待检位置加入杂交液和探针，置于杂交炉中避光杂交；

(6b)将步骤(5b)中获得的载玻片浸入预热的洗涤液中洗涤，然后烘干；

(7b)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用10×物镜扫视和计数，用40或100×物镜观察细菌形态。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1a)、(1b)中所述待检食品样品与所述重悬固定液的体积比为1:1～1:5，所述步骤(2a)中所述液体滴加的体积为10μL，所述步骤(3b)中所述滤液滴加的体积为10μL，所述步骤(2a)、(3a)、(5a)、(3b)、(4b)、(6b)中的烘干温度为52℃，所述步骤(3a)、(4b)中所述浸泡时间为5分钟，所述步骤(5a)、(6b)中洗涤液的预热温度为55℃，所述步骤(5a)、(6b)中所述洗涤时间为5分钟。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3a)、(4b)中所述杂交液的加入体积为20μL，所述探针加入后的终浓度为20ng/L。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3a)、(4b)中杂交温度为52℃，杂交时间为30分钟。