[发明专利]一种阳性质粒分子pBI121-Screening及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及转基因安全领域中转基因作物的安全监管和筛查检测技术，尤其涉及一种阳性质粒分子pBI121-Screening及其应用。

背景技术

近20多年来，全球转基因生物研发及商业化迅猛发展，2013年，全球已有27种作物涉及336个转化体获准商业化生产，种植面积超过17.5亿公顷，产生了巨大的经济效益(James，Briefs No.46 http://www.isaaa.org/purchasepublications/itemdiv.asp？ItemTyp  e＝BRIEFS&Control＝IB046-2013,2013)。与此同时，转基因生物的安全性问题一直备受社会各界关注，为此，包括中国、欧盟、美国、日本和韩国等在内50多个国家和地区纷纷颁布实施转基因生物安全管理法律法规，以规范转基因生物的研发和产业化应用(Chassy，Global Regulation of Transgenic Crops.Molecular Genetic Approaches to Maize Improvement,Biotechnology in Agriculture and Forestry,63,2009,107-124)。

根据监管需要，研究者针对不同的检测靶标开发出了不同的检测方法，包括筛查检测方法、构建特异性检测方法和转化事件特异性检测方法。其中，筛查检测方法检测的靶标是转基因作物中最常见的通用元件，如CaMV35启动子、NOS终止子等；而转化事件特异性检测方法检测的则是同一来源的转基因植株的特征序列。目前，世界上大多数国家均以转化事件为基础区别管理不同的转基因产品。转基因产业迅速发展，不断有新的转化事件推出，而且田间试验的频次也在逐年攀升，若只用事件特异性检测方法，容易造成转基因产品的漏检。在实际检测和执法工作中，检测机构首先利用筛查检测方法对样品进行筛查检测，做有无转基因成分的判断。但检测工作的开展、检测结果的质量控制和溯源都离不开标准物质。无论是目前在研的标准物质还是在售的标准物质，无论是基体标准物质还是质粒标准物质，绝大部分都是基于转化事件特异性检测的需要研制的，没有满足 转基因筛查检测需求的标准物质。目前转基因筛查检测阳性对照(标准物质)的缺乏阻碍了转基因检测工作的开展。

在转基因筛查检测中，由于缺乏标准物质，只能利用混合的转化事件特异性检测用标准物质作为参照标准，如欧盟利用转基因玉米Bt11和MON810的混合物作为转基因水稻筛查检测的标准物质。但利用转化事件特异性检测用标准物质的混合物进行转基因筛查存在多种问题：

1、某些特殊的转基因元件没有出现在合法的转化事件中，因此也没有对应的标准物质，如潮霉素抗性基因HPT在实验室研究中常用，但在商业化品种中完全没有，造成了这个元件的检测困难；

2、一般的转基因检测标准物质没有考虑各筛查元件的存在与否和拷贝数比值，当利用多种标准物质混合用于转基因筛查时，某些元件的拷贝数可能是其他元件的数倍，在作为阳性对照使用时，可能不能准确反映各检测参数的灵敏度是否一致和符合标准要求；

3、不同作物，甚至是同种作物不同品种，其DNA提取效率可能有较大差距，在欧盟转基因产品检测标准物质研制中就已发现转基因和非转基因原材料DNA提取效率存在30％以上的差异。在将混合的不同转化事件标准物质用于转基因筛查时，可能某些成分提取效率与其他成分有较大差异，造成检测灵敏度判断的误差。

在转基因筛查检测中，部分检测机构根据检测的靶标选用含有相应靶标的转化事件特异性检测用标准物质作为阳性对照，这样筛查检测中针对多个检测靶标设置了多个阳性对照，增大了提取DNA的工作量，而且为了考察DNA质量，还要多设置内标准基因的反应，进一步推高了检测成本，增大了检测的工作量，为检测工作造成不便。

结合上述考虑，以解决缺乏转基因筛查检测用标准物质这一难题为切入点，克隆常用转基因筛查元件和作物内标准基因，聚合构建到双元载体骨架上，研制转基因筛查检测用质粒标准物质。

经对现有专利和其他文献的检索，尚未发现任何关于转基因作物筛查检测通用的阳性质粒分子研制和应用的报道。

发明内容