[发明专利]一种鱼类凝集素的抗菌应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种鱼类凝集素的杀菌和抗菌应用。

背景技术

凝集素(lectin)是自然界广泛存在的一大类非免疫来源的、无酶活性的多价糖类结合蛋白,能使细胞发生凝集。凝集素结合的糖主要有甘露糖、葡萄糖和半乳糖。凝集素与糖以非共价键结合，结合力弱而且可逆，与酶和底物或抗原-抗体的反应类似。凝集素与互补大分子形成沉淀或使细胞凝集，所以每一个凝集素分子必须至少具有二个结合糖的位点，每一个位点适合一个糖或一个寡糖的几个糖单元的互补分子。凝集素主要由肝脏合成，某些凝集素可以通过结合病原微生物表面的糖基配体而介导巨噬细胞调理吞噬作用和/或通过凝集素途径激活补体,在机体的天然免疫防御中发挥重要作用。

发明内容

本发明目的在于提供一种鱼类(半滑舌鳎)凝集素的抗菌应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种鱼类凝集素的抗菌应用，凝集素用于制备杀菌或抗细菌感染的抑制剂。

所述凝集素用于制备鱼类杀菌或抗细菌感染的抑制剂。

所述细菌为哈氏弧菌；鱼类指半滑舌鳎。

所述凝集素为凝集素重组蛋白。

所述凝集素重组蛋白为经凝集素在大肠杆菌中表达获得重组蛋白。

所述重组凝集素蛋白为以半滑舌鳎cDNA为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增,PCR产物经过与载体pBS-T连接转换后与载体pET259连接，获得质粒pEtP113A，转化大肠杆菌BL21(DE3)即可表达重组凝集素。

本发明具有如下优点：本发明的凝集素能够杀死鱼类病原菌。

附图说明

图1为本发明实施例提供的纯化的凝集素重组蛋白。其中，泳道1，分子量标准；泳道2,凝集素。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

实施例1

凝集素P113A的重组蛋白的制备

1)表达凝集素P113A重组蛋白的质粒pEtP113A的构建：

本发明中的凝集素P113A的序列已报道(GenBank access ion numberXP_008316312.1)。凝集素P113A具有典型的甘露糖结合域(氨基酸30-38)。pEtP113A的构建如下：以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增。PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA,然后94℃40s,53℃ 60s,72℃ 60s,5个循环后改为94℃ 40s,59℃ 60s,72℃ 60s,30个循环。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室温连接2－4小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5α后在含有100μg/ml安卡青霉素、40μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷和24μg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18－24小时，挑出白色转化子，提取质粒，命名为质粒pBSP113A。将表达载体pET259(pET259构建过程参见Hu YH,Zheng WW,Sun L.Ident ificat ion and molecular analys is of a ferrit in subunit from red drum(Sciaenops ocellatus).Fish Shel lfish Immunol 2010；28:678-86)用限制性内切酶SwaI酶切后回收5.3kb，同时将pBSP113A用EcoRV酶切回收0.3kb片段。将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2－4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5a，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，即为pEtP113A。DNA测序表明pEtP113A含有编码凝集素P113A序列的基因。

所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。所述F1为5’-GATATCATGAACCAGAACTCACTCAG-3’；R1为5’-GATATCTTTTTTTTCAGCAGCCCA-3’。

2)重组凝集素蛋白的诱导表达和纯化