[发明专利]人类卵母细胞冷冻保护剂

说明书

技术领域

    本发明涉及人类卵母细胞冷冻保护剂，属于生殖医学工程领域。

背景技术

2006年1月，我国首例、全球第二例“三冻（冻卵、冻精、冻胚胎，再解冻移植入母体子宫内）”试管婴儿在北京大学第三医院诞生。目前，中国ART（辅助生殖技术）衍生技术的应用范围和技术水准已处于世界前列。随着全球性不孕人口上升，女性育龄的推迟、癌症患者的增加，女性生育能力保存的需求也日益增加。卵子冷冻技术也已逐步应用于临床，与冷冻胚胎相比较，冷冻卵子一方面可使许多宗教、法律及伦理问题得以解决，另一方面对于因生殖系统疾病导致卵巢功能损伤甚至散失的妇女，如早发性卵巢衰竭、子宫内膜异位症及接受化学治疗或放射线治疗恶性肿瘤的患者，卵子冷冻是保存此类妇女生育能力的有效途径。

尽管人类卵子冷冻技术近年来取得了较大的突破，成活率大大提高，但卵子冷冻至今仍未能像胚胎及精子冷冻在辅助生殖技术领域常规开展。根本原因是由于成熟卵母细胞（卵子）体积大、所含水分多、膜的渗透性低，冷冻过程中易形成冰晶，对卵子产生损伤，并且对染色体的重新排列产生影响，导致纺锤体异常，所以冻融后的卵子受精率不高，卵裂率低，胚胎发育潜能低下，造成卵子冷冻技术进展较为缓慢 。因此开发一种高效安全的人类卵子冷冻保护剂是解决人类卵子冷冻效果低下的唯一路径。

现有的卵子冷冻保护剂均选用蔗糖为非渗透性保护剂，和选用丙二醇（propanediol， PROH）、乙二醇（ethylene glycol，EG）或二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）等为渗透性抵抗剂。冷冻保护剂的广泛使用旨在防止卵子在冻融过程中细胞内因脱水不完全引发冰晶的形成，冰晶的形成会对卵子的亚细胞结构造成损伤。目前，国际上现有的卵子冷冻保护剂一般分两部分组成，即卵子冷冻液和卵子解冻液，冷冻液又分为平衡液和冷冻液两组，而解冻液根据所含非渗透性保护剂浓度的不同分别分为复苏液，稀释液1，稀释液2及清洗液等4组。现有的卵子冷冻保护剂的配方如下：

卵子冷冻液：

平衡液：75%缓冲液（V/V）+ 10%SPS（V/V）+ 7.5%PROH（V/V）+7.5%EG（V/V）;

冷冻液：60%缓冲液（V/V）+10%SPS（V/V）+15%PROH（V/V）+15%EG（V/V）+0.5mol/LSucrose(蔗糖)

卵子解冻液：

复苏液： 90%缓冲液（V/V）+ 10%SPS（V/V）+1.0 mol/L Sucrose(蔗糖);

稀释液-1：90%缓冲液（V/V）+ 10%SPS（V/V）+0.5 mol/L Sucrose(蔗糖);

稀释液-2：90%缓冲液（V/V）+ 10%SPS（V/V）+0.25 mol/L Sucrose(蔗糖);

清洗液：90%缓冲液（V/V）+ 10%SPS（V/V）。

缓冲液涵盖HTF 1024（SAGE, USA），HTF1023（SAGE, USA）, GMOPS（Vitrolife, Sweden）,及DPBS（SAGE, USA）,等；SPS（SAGE, USA）是人体血清替代物；蔗糖(Sucrose，SIGMA，USA)，另V/V代表体积比。

现有技术通常在渗透性冷冻保护剂中添加非渗透性保护剂及大分子的物质或联合应用几种冷冻剂，可在冷冻过程中保护卵母细胞膜，从而减少冷冻保护剂的毒性，提高卵母细胞的成活率。目前，蔗糖作为非渗透性冷冻保护剂常规应用于卵子冷冻培养基中，但卵母细胞在冷冻过程中易形成冰晶，对卵子产生损伤，并且对染色体的重新排列产生影响，导致纺锤体异常，所以冻融后的卵子受精率不高，卵裂率低，胚胎发育潜能低下。

发明内容

    本发明的目的在于提供了一种人类卵母细胞冷冻保护剂，该保护剂以海藻糖作为非渗透性保护剂以卵子冷冻培养基冻融人类卵子。

本发明的人类卵母细胞冷冻保护剂，包括卵子冷冻液和卵子解冻液，所述卵子冷冻液包括平衡液和冷冻液，其组成为：

平衡液（EM）：60%缓冲液（V/V）+ 20%人血清替代物（V/V）+ 10%PROH（V/V）

+10%EG（V/V），

冷冻液（VM）：40%缓冲液（V/V）+20%人血清替代物（V/V）+20%PROH（V/V）

+20%EG（V/V）+0.65mol/L 海藻糖；