[发明专利]利用α-L-鼠李糖苷酶催化柚皮苷合成普鲁宁的方法

说明书

技术领域

本发明属于天然产物生物合成领域，具体涉及一种利用α-L-鼠李糖苷酶催化柚皮苷合成普鲁宁的方法。

背景技术

柚皮苷，学名为柚皮素-7-β-D-葡萄糖(2→1)-α-L-鼠李糖，在α-L-鼠李糖苷酶的作用下脱去一个L-鼠李糖基生成普鲁宁(柚皮素-7-O-葡萄糖苷)。普鲁宁的苦味为柚皮苷的三分之一，而且具有多种功能。普鲁宁对DNA/RNA病毒具有不同的抗过滤性病毒活性和抗炎活性，还可以作为糖尿病患者的甜味剂，也可作为药物原材料，用来合成各种化学医用药物，如用于合成毛细管扩展的药物等，可以被人体良好的吸收。

普鲁宁是一种二氢黄酮类化合物，最初由南朝鲜民间药物山桃中提取得到的，其在自然界中主要分布于苏木科、蔷薇科、大戟科等植物中。其水溶性、脂溶性差，较难获得，价格昂贵 。目前普鲁宁的制备方法主要有一下两种，化学提取法和酶法水解柚皮苷法。利用酶法水解柚皮苷制备普鲁宁的条件温和、转化率高、安全环保，因此研究酶法制备普鲁宁具有很高的应用价值。

在酶的生物转化研究中，许多底物在水中溶解性较差，因此需要通过某些方法或途径来增大酶与底物的接触机会，从而提高底物的转化率或增加产物的生成量。目前常用的方法是改变酶催化反应的介质，其中研究最多、应用最广的是有机溶剂，但有机溶剂酶催化反应缺点多，能直接或间接地与底物或产物发生作用并改变酶蛋白质分子的结构，破坏酶的催化活性，降低酶的稳定性；有机溶剂使后期的分离纯化比较困难。

有鉴于此，本发明人研究和设计了一种利用α-L-鼠李糖苷酶催化固定化柚皮苷合成普鲁宁的方法，本案由此产生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种α-L-鼠李糖苷酶催化固定化柚皮苷合成普鲁宁的方法。该方法可以高效地实现定向水解柚皮苷分子中的α-L-鼠李糖苷键，为酶法制备高纯度普鲁宁的工业化应用提供了新工艺。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是：

一种利用α-L-鼠李糖苷酶催化固定化柚皮苷合成普鲁宁的方法，包括以下步骤：

步骤一、制备固定化柚皮苷：

将柚皮苷溶解于pH 4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中，得到浓度为2.0 g/L的柚皮苷底物溶液，向所述柚皮苷底物溶液中加入大孔吸附树脂，置于50℃水浴中恒温振荡充分固定，使柚皮苷吸附并固定于大孔吸附树脂中，制得固定化柚皮苷溶液；

步骤二、α-L-鼠李糖苷酶催化固定化柚皮苷合成普鲁宁：

向所述固定化柚皮苷溶液中加入浓度12U/mL的α-L-鼠李糖苷酶酶液，置于 60℃恒温振荡水浴中进行酶解反应，振荡速率80 r/min，反应时间300 min，α-L-鼠李糖苷酶酶液催化固定化柚皮苷合成普鲁宁，获得含水解产物普鲁宁的转化液，普鲁宁被吸附至大孔吸附树脂中；

步骤三、普鲁宁的分离纯化：

所述酶解反应结束后，过滤收集大孔吸附树脂并装柱，采用体积比为80:20:4.8的丙酮-氯仿-水作为洗脱剂对大孔吸附树脂进行洗脱，同时采用薄层色谱法对洗脱液进行跟踪检测，将只含有普鲁宁的洗脱液进行合并，而后利用旋转蒸发仪在60°C下减压蒸发浓缩，甲醇反复重结晶2次，得普鲁宁样品。

作为实施例的优选方式，固定化所用的大孔吸附树脂的材料为聚苯乙烯，极性为非极性或弱极性，比表面积为480~800 m²/g，平均孔径为90~450A。

作为实施例的优选方式，还包括采用TLC薄层色谱法对步骤二所述转化液进行检测，其中，展开剂：丙酮-氯仿-水（体积比为80:20:4.8)；显色剂：3g香兰素，50mL无水乙醇，0.5mL浓硫酸。

作为实施例的优选方式，还包括采用HPLC法对步骤二所述转化液进行检测，检测条件为：反相柱的柱温 35°C，紫外检测波长 280 nm，进样体积 20 μL，流速 0.4 mL/min，走样时间 20 min，流动相为水、甲醇及乙腈，梯度洗脱。

本发明首次应用α-L-鼠李糖苷酶催化水解固定化柚皮苷，实现普鲁宁的定向生物合成。该方法条件温和，反应产物较单一，产物得率高，环境友好；此外，可以克服以往酶促水解产物多样性问题，易于工业化生产高纯度普鲁宁，为今后大规模工业化生物合成普鲁宁的应用奠定了基础，为推动医药、食品、化妆品等工业中的广泛应用具有十分重要的意义。现有的固定化技术，一般用于将酶固定在载体上，本发明人反其道行之，将底物固定在载体上，以改变酶催化反应的微环境，将底物固定在固相介质中与酶进行反应可大大提高底物浓度及酶的活性和稳定性，为柚皮苷和其他物质的生物转化提供了一条新的途径。