[发明专利]一种羊口疮病毒的快速分离方法有效
| 申请号： | 201510077329.2 | 申请日： | 2015-02-13 |
| 公开（公告）号： | CN104694484B | 公开（公告）日： | 2018-04-06 |
| 发明（设计）人： | 陈德坤;刘方;周铭;刘鹤媛;岳进华;高洋;赵燕青 | 申请（专利权）人： | 西北农林科技大学 |
| 主分类号： | C12N7/00 | 分类号： | C12N7/00;C12R1/93 |
| 代理公司： | 西安新思维专利商标事务所有限公司61114 | 代理人： | 韩翎 |
| 地址： | 712100 陕西省西安市杨*** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 种羊 口疮 病毒 快速 分离 方法 | ||
【权利要求书】：
1.一种羊口疮病毒的快速分离方法，其特征在于：所述的分离方法的步骤为：
1）羊口疮病毒病料的采集与检测：
羊口疮病毒病料的采集来源于发病羊及隐性带毒羊的外周血，病料的检测方法为PCR检测；
2）病料的处理：
病料的处理的方法为反复冻融3次后，在3000r/min离心5min后, 取上清液，用等体积0.01M PBS稀释，然后用0.22微孔滤膜过滤，得到滤液，在-20℃保存备用；
3）羊口疮病毒的分离：
羊口疮病毒的分离方法为：病毒分离所使用的细胞为牛睾丸细胞，牛睾丸细胞的培养基为M199，培养基中添加体积比为10%的犊牛血清，牛睾丸细胞在37℃，5%CO2培养2-3天，待细胞铺满培养瓶底80%时，取1.5mL-2mL步骤2）所述滤液，接种牛睾丸细胞，37℃，5%CO2培养箱孵育1-1.5h后，加10mL细胞维持液，细胞维持液为含5%犊牛血清的M199培养基，换液后每隔24h轻轻晃动培养瓶，72h时将细胞培养物反复冻融3次，然后无菌收集细胞培养物，为第1代无菌收集细胞培养物；取600uL第1代无菌收集细胞培养物接种牛睾丸细胞，按照第1代细胞培养物制备方法，制备第2代无菌细胞培养物；第2代无菌细胞培养物接种牛睾丸细胞后的第48h、72h可观察到细胞病变；收集第3代细胞病变培养物，该培养物中含有大量羊口疮病毒。
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