[发明专利]一种高效介导Lnc-MEG3基因过表达的慢病毒载体

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和基因治疗领域，具体为一种高效介导lnc-MEG3基因过表达的慢病毒载体系统的建立。

背景技术

lncRNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类转录本长度大于200bp的非编码RNA，可作为人类基因组中一类重要的调控分子通过多种方式发挥其生物学功能。近年来的研究表明，lncRNA也可以作为一种竞争性内源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)与10miRNA相互作用，参与靶基因的表达调控，并在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。

lncRNAs作为一种新型肿瘤标志物，它在肿瘤发生、发展的调控过程中起着非常重要的作用，这种机制能为人们治疗肿瘤提供新的思路。目前人们对绝大多数lncRNAs的生物和分子特性所知甚少，但是随着生物信息学发展，二级结构以及三级结构分析会为lncRNAs的研究提供重要的手段，特别是其与编码序列之间的相互作用关系，这一方向的发展将会拓展出全新的研究领域。大量由临床观察和实验研究所得的结果表明，lncRNAs的异常表达会导致很多疾病的发生，这种机制在癌生物学中尤为重要。尽管涉及肿瘤的大多数lncRNAs的作用机制还没得到准确阐明，但就其对部分已知lncRNA的研究发现，其参与染色质重构和组蛋白修饰的调控，特别是通过表观遗传的修饰调控(例如基因印迹和组蛋白修饰)会影响肿瘤的发生和迁移。例如，HOTAIR能通过调控染色质位点重排促进肿瘤转移，而linc P21通过p53途径将RNADNA结合蛋白hnRNPK结合到染色质上实现其抑制剂作用。

母系表达基因3(MEG3)是首次由Miyoshi等在2000年发现的小鼠母系表达基因，它是基因捕获基因座2(gene traplocus2，Gtl2)的人类同系物，定位于染色体14q32.3，长度约为1.6kb。MEG3能编码出一条在许多正常组织中表达的lncRN A，但是它在初级肿瘤患者和肿瘤细胞系中是缺失的(包括基因缺失，启动子高度甲基化和基因间位点的甲基化等多重机制是造成MEG3基因缺失表达的主要因素)。研究发现，ME G3的重新表达能促进细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞增殖。M EG3还能造成p53的积累，刺激p53介导的转录激活并且选择性地调控p53靶基因表达。例如在小鼠中MEG3的去除能导致小鼠骨骼肌缺陷和围产期死亡，而MEG3的失活能导致大脑中促血管生成基因表达增加和微脉管形成，这些证据都表明MEG3能作为一个lncRNA肿瘤抑制剂。

目前对LncRNA的研究正如日中天，而LNC-MEG3为印记基因，其在正常组织中高表达，而在肿瘤组织中低表达，目前已证明其具有抑癌基因的功能，那么，如何提高其在肿瘤细胞中的表达效率进而对其抑癌基因的功能基因鉴定，需要高效、稳定的过表达基因研究的工具.

有效的基因治疗依赖于外源基因高效、稳定的表达。肿瘤抗原基因导入细胞的方法一般有两大类：一是以腺病毒、逆转录病毒、痘病毒和腺病毒相关病毒等为载体的病毒载体方法；二是DNA脂质体复合物、磷酸钙沉淀、电穿孔等非病毒载体方法。非病毒载体方法转染的优势在于：插入片段大小不受限制；免疫原性低；生产简便。其缺点是外源基因的转染效率一般很低。病毒载体介导方法，以其高转染率和良好的靶向性成为肿瘤基因治疗中应用最广泛的方法。利用病毒载体将带有肿瘤或病毒抗原的编码基因转染树突状细胞制备的疫苗，由于可以在细胞内加工和持续表达相应特异性抗原，诱导产生特异性抗肿瘤或抗病毒免疫应答而备受关注。其中最常用的包括逆转录病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)和腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)等载体。

慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

常用的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒和慢病毒。逆转录病毒载体只能感染分裂期细胞，而且容量有限，腺病毒一般不能整合到染色体上，只能进行瞬时感染。与其它逆转录病毒相比，慢病毒(LV)具有可以感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大，可以长期表达等显著优点。慢病毒不产生任何有效的细胞免疫应答，可作为一种体外基因运输的工具。慢病毒载体介导的转基因表达能持续数月，且无可观察到的病理学现象。

慢病毒包装系统一般由慢病毒表达载体和慢病毒包装载体组成。