[发明专利]一种基因沉默试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基因沉默试剂盒及方法。

背景技术

脱氧核酶(DNAzyme)是利用体外分子进化技术合成的一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力。1982年发现具有生物催化活性、能特异性地自我剪切的RNA分子-Ribozyme后，完全打破了酶的化学本质是蛋白质的传统观点,同时也给mRNA水平反义基因干预治疗带来了新的活力,开创了从反mRNA策略出发进行基因治疗的新思路。DNAzyme和一般的生物酶一样，都包含有结合部位和催化部位。DNAzyme具有(1)RNA切割作用；(2)DNA切割作用；(3)金属螯合作用；(4)过氧化物酶活性；(5)DNA激酶活性(6)DNA连接酶活性等多种催化功能，而且还对靶RNA能产生序列特异性切割效应,从mRNA水平对基因灭活,从而调控蛋白的表达,因此成为了对抗RNA病毒感染、肿瘤等疾病的新型工具。DNAzyme具有很多优点:(1)作为DNA分子相较于Ribozyme更稳定，不易被破坏；(2)分子量相对较小，易于人工合成和修饰，而且成本较低；(3)其与底物配对的精确度高，除了催化部位，其他碱基序列可根据底物碱基序列进行改变，在RNA切割效率方面高于Ribozyme(Stephen W.Santoro,Gerald F.Joyce.A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1997,94(9):4262-4266.)；(4)DNAzyme具有与一般药物相似的动力学特点，对靶RNA水平的抑制程度及抑制时间容易控制。对于脱氧核酶的研究有望成为基因功能研究、核酸突变分析、治疗肿瘤、对抗病毒及肿瘤等疾病的新型基因治疗药物的新型核酸工具酶。

10-23DNAzyme是Santoro等从1014个随机序列中通过体外PCR筛选法得到的第10轮循环的第23个克隆，因此而得名。该酶活性中心由15个脱氧核糖核苷酸序列组成，为“10-23基序(motif)”—5’-GGCTAGCTACAACGA-3’(Wu,Y,Yu,L,McMahon,R et al.Inhibition of bcr-abl oncogene expression by novel deoxyribozymes(DNAzymes).[J].Human gene therapy,1999,10(17):2847-2857.)，而且第八个碱基可以为T、C或A，当为T时活性最高，而其他序列高度保守。活性中心两端为底物结合区，其长度一般为7～9nt，与靶RNA通过Watson-Crick碱基配对进行特异性结合(Santoro SW；Joyce GF.Mechanism and utility of an RNA-cleaving DNA enzyme[J].Biochemistry,1998,37:13330-13342)。

在众多影响DNAzyme是因素中，二价金属阳离子对于DNAzyme的影响较大，因为二价金属阳离子在DNAzyme的反应形成过渡态的过程中，能起到稳定作用，有助于其折叠成活性结构。而根据研究表明，其影响能力大小为：Mn²⁺(EPPS)>Pb²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺>Cd²⁺(Tris)>Sr²⁺、Ba²⁺>>Zn²⁺、Co²⁺(Flynn-Charlebois A,Wang Y,Prior T K,et al.Deoxyribozymes with 2'-5'RNA ligase activity[J].Journal of the American Chemical Society,2003,125(9):2444-2454.)。

但是DNAzyme作为基因沉默的工具用于治疗的报道却很少，主要原因是在细胞内二价金属离子的含量比较低，即使是含量相对较高的Mg²⁺也远不能满足10-23DNAzyme催化切割RNA的要求。