[发明专利]一种鲑肾杆菌的检测方法

权利要求书

1.一种鲑肾杆菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、取待检样品，并进行预处理；

2)、对预处理后的样品进行细菌核酸提取，以提取到的核酸为模板，以P3和M21为引物进行PCR扩增；

3)、以步骤2)得到的扩增片段为模板，以P4和M38为引物进行PCR扩增；

4)、将步骤2)和步骤3)得到的扩增片段分别进行琼脂糖凝胶电泳、回收以及测序后分别与如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列进行同源性比对分析；

其中，P3、M21、P4和M38的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

2.权利要求1所述的鲑肾杆菌的检测方法，其特征在于，在步骤1)中：

所述预处理包括将待检样品研磨后并加入血清体积百分含量为8-12％的199细胞培养液。

3.根据权利要求1所述的鲑肾杆菌的检测方法，其特征在于，在步骤1)中，所述待检样品取自待检个体的肝或肾。

4.根据权利要求1所述的鲑肾杆菌的检测方法，其特征在于，在步骤2)中：

所述PCR扩增的反应体系为：模板8-12μl，10Mm的dNTP1-3μl、100pmol/μl的P3 2-3μl，100pmol/μl的M21 2-3μl，25mM的MgCl₂9-11μl，10×PCR buffer 8-12μl，5U/μl的Taq酶1μl，DEPC水补齐至100μl。

5.根据权利要求4所述的鲑肾杆菌的检测方法，其特征在于，在步骤2)中：

所述PCR扩增的反应的程序为：94℃预变性4-5min；94℃变性28-32s，60℃退火28-32s，72℃延伸60-70s，共30-35个循环。

6.根据权利要求1所述的鲑肾杆菌的检测方法，其特征在于，在步骤3)中：

所述PCR扩增的反应体系为：模板4-6μl，10Mm的dNTP1-3μl、100pmol/μl的P4 2-3μl，100pmol/μl的M38 2-3μl，25mM的MgCl₂9-11μl，10×PCR buffer 8-12μl，5U/μl的Taq酶1μl，DEPC水补齐至100μl。

7.根据权利要求6所述的鲑肾杆菌的检测方法，其特征在于，在步骤3)中：

所述PCR扩增的反应的程序为：所述PCR扩增的反应的程序为：94℃预变性4-5min；94℃变性28-32s，60℃退火28-32s，72℃延伸60-70s，共30-35个循环。

8.根据权利要求1-7任一项所述的鲑肾杆菌的检测方法，其特征在于，在步骤4)中：

若步骤2)得到的扩增片段在进行琼脂糖凝胶电泳时，有特异性条带，则在步骤3)中，所述模板为将步骤2)中获得的扩增片段经过100-1000倍稀释后的片段。

9.根据权利要求1-7任一项所述的鲑肾杆菌的检测方法，其特征在于，在步骤4)中：

所述琼脂糖凝胶电泳中所用的琼脂糖凝胶的浓度为1-2％，且含有0.4-0.6μg/mL的EB；所述琼脂糖凝胶电泳的电场强度为4-6V/cm，时间为0.4-0.6h。

10.根据权利要求1所述的鲑肾杆菌的检测方法，其特征在于，在步骤1)之前，还包括：

对待检样品进行组织切片后革蓝氏染色，并于×1000的视野下进行镜检，观察所述组织切片是否含有革兰氏阳性短杆菌。