[发明专利]一种用于敲除L-乳酸脱氢酶1基因的载体及构建方法在审
| 申请号： | 201510070716.3 | 申请日： | 2015-02-10 |
| 公开（公告）号： | CN104673819A | 公开（公告）日： | 2015-06-03 |
| 发明（设计）人： | 刘冬梅;费永涛;黄娟;陈思敏;黄智斌 | 申请（专利权）人： | 华南理工大学 |
| 主分类号： | C12N15/74 | 分类号： | C12N15/74;C12N15/53;C12R1/25 |
| 代理公司： | 广州市华学知识产权代理有限公司 44245 | 代理人： | 宫爱鹏 |
| 地址： | 510640 广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 用于 乳酸 脱氢酶 基因 载体 构建 方法 | ||
【权利要求书】：
1.一种用于敲除L-乳酸脱氢酶1基因的载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)从NCBI中找到L-乳酸脱氢酶1编码基因的位置及其上下游800～1000bp的DNA序列，然后确定保守序列设计引物并引入重叠片段，提取植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMDL 9010的DNA，并以此为模板，扩增得到不含L-乳酸脱氢酶编码基因的该基因的上下游DNA片段，利用高保真酶进行重叠延伸PCR连接该基因的上下游DNA片段；所述植物乳杆菌DMDL的保藏编号为CGMCC NO.5172；
(2)将上述连接片段的3′端进行加A反应后与pMD18-T载体进行连接反应并转化到大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，最后得到亚克隆载体，然后大量制备亚克隆载体，进行XhoⅠ和PstⅠ双酶切，在重叠片段上引入粘性末端；
(3)将经过XhoⅠ和PstⅠ双酶切处理的pG+host9质粒与步骤(2)制得的重叠片段进行连接反应，然后将此连接产物化转到大肠杆菌MC1061或TG1中，于红霉素抗性平板上进筛选阳性转化菌，得到重组载体。
2.根据权利要求1所的构建方法，其特征在于，所述重叠延伸PCR的条件为：单步重叠延伸PCR，模板浓度为0.4ng/μl，引入引物的重叠片段为15bp。
3.权利要求1或2所述方法构建的载体。
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