[发明专利]大黄鱼白细胞介素8基因大肠杆菌表达产物及制备与应用

权利要求书

1.可高效表达大黄鱼白细胞介素8基因的大肠杆菌工程菌，其特征在于为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-His-IL-8，已于2015年1月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2015053。

2.大黄鱼白细胞介素8基因大肠杆菌表达产物，其特征在于为分子量约10kDa的大黄鱼IL-8重组蛋白。

3.大黄鱼白细胞介素8基因的cDNA序列及推断的氨基酸序列如下：

其中，下划线部分为预测的大黄鱼IL-8信号肽；阴影部分标示推断的大黄鱼IL-8成熟肽序列；星号表示终止密码子。

4.如权利要求2所述大黄鱼白细胞介素8基因大肠杆菌表达产物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)克隆大黄鱼IL-8基因全长cDNA序列，再采用PCR技术扩增出编码第23～99位氨基酸的大黄鱼IL-8成熟肽基因片段；

2)将步骤1)得到的大黄鱼IL-8成熟肽基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-His，得到含大黄鱼IL-8基因片段的重组表达载体pET-His-IL-8；

3)将重组表达载体pET-His-IL-8转化大肠杆菌BL21菌株，经氨苄青霉素筛选及测序鉴定后，获得含有大黄鱼IL-8基因片段的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-His-IL-8；同时，表达载体pET-His转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-His-IL-8，获得的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-His-IL-8作为对照菌株；

4)将步骤3)获得的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-His-IL-8在LB培养基中经IPTG诱导、振荡培养，将培养物离心收集菌体，Buffer A重悬后，超声破碎，分别收集菌体裂解液上清和菌体裂解液沉淀，经聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE分析证明大黄鱼IL-8重组蛋白以包涵体形式表达；

5)利用镍离子鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)纯化大黄鱼IL-8重组蛋白：离心收集大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-His-IL-8培养物中菌体，用包涵体洗涤液重悬菌体，第1次超声破碎，离心收集沉淀，再用包涵体裂解液重悬沉淀，第2次超声破碎，离心收集上清后上柱，4℃结合2h，用杂蛋白洗涤液洗柱，再用尿素洗柱，最后用变性蛋白洗脱液洗脱，获得大黄鱼IL-8重组蛋白，纯化后的大黄鱼IL-8重组蛋白分别经缓冲液B、缓冲液C、缓冲液D进行3步透析，即得到具有生物学活性的大黄鱼IL-8重组蛋白；缓冲液B的组成为：3M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.25M咪唑、0.1mM氧化型谷胱甘肽、0.5mM还原型谷胱甘肽、5％甘油和0.005％Tween 20；缓冲液C的组成为：1M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.125M咪唑、0.1mM氧化型谷胱甘肽、0.5mM还原型谷胱甘肽、5％甘油和0.005％Tween 20；缓冲液D的组成为：20mM Tris-HCl、150mM NaCl和5％甘油。

5.如权利要求4所述大黄鱼白细胞介素8基因大肠杆菌表达产物的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述LB培养基的组成为：10g/L蛋白胨、5g/L酵母抽提物、10g/L氯化钠；所述IPTG的摩尔浓度可为0.1mM；所述振荡培养的条件可于37℃振荡培养4h。

6.如权利要求4所述大黄鱼白细胞介素8基因大肠杆菌表达产物的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述Buffer A的组成为：20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.5％Triton X-100和30mM咪唑，pH 7.9。

7.如权利要求4所述大黄鱼白细胞介素8基因大肠杆菌表达产物的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述包涵体洗涤液的组成为：2M尿素、20mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA和0.5％Triton X-100，pH 7.9；所述第1次超声破碎的时间可为10min。