[发明专利]表达海肾或萤火虫荧光素酶基因的PRRSV重组质粒的构建方法以及应用

说明书

背景技术：

本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种病毒的重组质粒的构建方法和应用，更具体地说，涉及到能够表达海肾和萤火虫荧光素酶的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒的构建与其在指征PRRSV复制水平上的应用。

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是一种严重影响养猪业的接触性传染病，给世界各国造成的经济损失巨大。其病原PRRSV一直处于不断的变异及进化过程中。目前，反向遗传操作被广泛应用于研究PRRSV的生物学特性、致病机理、毒力决定因子以及不断变异的分子机制，而其基因组作为外源基因表达载体的研究也被广泛开展。PRRSV的基因组中除ORF1和ORF2以及ORF4和ORF5外，其结构蛋白编码框架之间有少则几个多则逾百的碱基重叠(overlap)。相关研究表明：ORF重叠区的影响会导致嵌合病毒失去感染性，因此可选择非重叠区或者将重叠区拉开作为外源基因的插入位点。需要注意的是外源基因的插入原则应以能在最小程度上改变病毒基因组为基础。但即便如此，插入外源基因也会在传代过程中逐渐丢失编码序列以致无法发挥其功能。呈现遗传不稳定性。Dr.DongwanYoo 2009年报道了其在ORF1b和ORF2之间插入了GFP基因，如果在其3′端下游插入一个二级结构简单的(由其自身及周围序列形成)转录调控序列6(TRS6)的拷贝，让外源基因的表达被一个独立的转录子所引导。所构建的突变体克隆能够在至少37代次的传达过程中保遗传稳定。Dr.Chengbao Wang的研究则表明TRS6拷贝的插入同样能够使在其他位点插入的外源序列稳定。而Dr.Dongwan Yoo在构建时在外源基因插入点的5′端和3′端分别引入了两个外源的酶切位点Afl II和Mlu I，以方便下游的替换或者插入操作，但是这或多或少可能对亲本病毒的生物学特性造成影响。Dr.Chengbao Wang所依赖的反向遗传操作系统是细菌人工染色体，而其外源基因的插入位点在ORF7和3′UTR之间。这个位点并没有编码基因的重叠，另外ORF7编码的是PRRSV病毒表达量最大的核衣壳蛋白(N protein)，因此这里也是外源基因插入的一个很好的选择。而他们同样选取了TRS6作为外源基因的转录调控序列。在TRS6的引导下，GFP这个外源基因仍然得到了很好的稳定的表达。

荧光素酶(英文名称：Luciferase)是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为Photinus pyrail的萤火虫体内的荧光素酶。在相应的化学反应中，荧光的产生是来自于荧光素的氧化，有些情况下反应系统中也包括三磷酸腺苷(ATP)。萤火虫发出的淡黄绿色的光是由其体内的荧光素酶产生的，这并不是一个简单的过程，早在很久以前，人们就已经通过对细菌、真菌、海葵及萤火虫的研究，发现了生物的发光现象。荧光素酶的辅因子，即荧光素，能与氧结合形成一个高度紧张的复合物，当这个氧化物在ATP的参与下被破坏时，产生CO2，从而形成具有较高活性的形式，即可发光。与O2结合的是荧光素酶中的荧光素，222酶蛋白种类多样，决定了荧光素也有不同的大小和形状。对发光系统进行分析发现荧光素或荧光素酶不是特定的分子，而是对于所有能够产生荧光的底物和其对应的酶的统称，虽然它们各不相同，不同的能够控制发光的生物体用不用的荧光素酶来催化不同的发光反应，最为人所知的发光生物是萤火虫，另外目前应用比较广泛的海肾荧光素酶的生物体海肾。在本发明中，所插入的海肾荧光素酶基因来源于pGMR-TK，其编码基因为936bp，萤火虫荧光素酶基因来源于pGL3-Basic，编码基因长度为1653bp。

在本发明中，在高致病性蓝耳病细胞致弱疫苗株HuN4-F112的全长感染性克隆骨架的ORF1b和ORF2a之间分别插入了海肾荧光素酶基因和萤火虫荧光素酶基因，获得了能够稳定表达这两个荧光素酶基因的重组PRRSV：pA-Rluc和pA-Flue，对其进行一系列病毒特性分析及遗传稳定性检测；并在病毒复制、转录、翻译水平对其与亲本病毒进行比较分析。并通过用这两个带有荧光素酶基因的突变病毒vA-Rluc和vA-Flue感染MARC-145和PAM之后，收取细胞裂解物对其进行荧光素酶活性检测的方法对病毒在细胞上的复制水平进行比较分析，对其作为指征病毒复制水平的一种指标进行评估。

发明内容：

本发明的目的在于，提供表达海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶基因的PRRSV重组质粒的构建方法。