[发明专利]一种高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株及其分子标记筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及的根瘤菌菌株及其筛选方法，具体地说是一种高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株及其分子标记筛选方法。

背景技术

紫花苜蓿，原名：紫苜蓿，又名：苜蓿，拉丁文名：Medicago sativa，豆科、属多年生草木植物，根粗壮，深入土层，根颈发达，是一种适口性好、营养价值和开发价值很高的牧草，业内有“牧草之王”的称号。紫花苜蓿的生长主要依靠根瘤菌与其建立共生关系共生固氮完成的。研究表明，根瘤菌与紫花苜蓿共生关系的建立是细菌、植物及环境三方相互作用的结果，所以无论是在紫花苜蓿的原产地还是引种地，只有接种适应于当地环境的根瘤菌并与紫花苜蓿建立良好的共生关系，才能有效保证紫花苜蓿的高产。目前，为提高紫花苜蓿产量，行业内主要通过以下两种方法来筛选菌株并接种生产的：第一、对分离紫花苜蓿的根瘤菌进行接种生产，一般以所结根瘤数较多的菌株作为筛选的菌株；该方法对分离的菌株未进行分类及剔除，所以筛选的菌株中部分可能不是根瘤菌菌株，而且从我们研究的结果也显示了部分所结根瘤数多的植株其干重并不一定高，也就是固氮效果并不一定好；第二、进行田间接种试验，仅依靠所结根瘤数和植物生长干重等来确定高效苜蓿根瘤菌菌株；这种方法虽在适应当地土壤环境较第一种方法有些许改善，但是仍然存在筛选菌株不纯的问题。可见，以上两种方法均依靠经验判断来筛选菌株，其方法欠科学、精准性差、所接种的根瘤菌杂菌多、纯度低、固氮效率低，更主要的是应用于某些特定土壤环境（如中度和中低度盐碱地土壤、滨海盐碱地、内陆盐碱地、南方酸性土壤，稻田土壤或山地土壤）等，难以与紫花苜蓿建立良好的共生关系以实现紫花苜蓿的高产目标。因此，能够研发出一种高效固氮根瘤菌菌株精准有效的筛选方法，并培育出适合于当地气候、土壤环境并与紫花苜蓿有效匹配共生固氮的高效新菌株，是当前行业内积极探索的课题。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株及其分子标记筛选方法，以解决现有筛选方法得到的根瘤菌菌株类型混杂、固氮效率低、应用于紫花苜蓿生产中无法实现高产的问题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株，所述菌株保藏名称是中华草木犀根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）729-2-4，保藏单位CGMCC，保藏号是CGMCC No.9755，保藏日期2014年10月10日。保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明所提供的高产紫花苜蓿根瘤菌菌株，其生物学特征如下：生长最适温度为28℃，好氧性培养物，在YMA培养基上菌落呈半透明，乳白色，圆形，边缘薄，中间厚，稀薄，生长时间48-72小时，菌落大小为3-5mm；细菌菌体杆状，具有折光性强的羟脂酸颗粒，占细胞的1/3体积，两端略圆，大小为2-3μm×3-5μm，革兰氏阴性菌，革兰氏染色为红色。

一种高效固氮紫花苜蓿根瘤菌菌株的分子标记筛选方法，包括以下步骤：

（a）对土壤种植的紫花苜蓿的根瘤进行取样，每颗根瘤经过分离和纯化获得一个菌株，得若干菌株；

（b）将所述若干菌株进行16S rDNA序列测定，将所测菌株的序列与GENEBANK数据库中根瘤菌类群的标准序列进行比对，将不属于根瘤菌类群的菌株剔除，将归属于根瘤菌类群的菌株保留；

（c）将保留的菌株进行全细胞蛋白SDS-PAGE的电泳图谱指纹测定，得原接种菌株图谱类型；

（d）将保留的菌株斜面培养到对数生长期，用生理盐水收集斜面的菌体，得菌体混悬液；

（e）在花盆中盛放由所述土壤、蛭石和沙子组成的混合培养基，播种紫花苜蓿种子，待种子发芽后，消毒，催芽至胚根为0.5-1.0cm时，即可将所述菌体混悬液中的菌株接种到种子上；生长45天后，检测其单株的根瘤数和干重，以其所结根瘤数多和单株干重高为综合选择目标，筛选出综合排名前5-10名的菌株；

（f）对步骤（e）筛选出的菌株斜面培养到对数生长期，用生理盐水收集斜面的菌体，将菌体离心收集，并悬浮于生理盐水中；

（g）在小区试验地点的土壤环境中播种紫花苜蓿种子，接种步骤（f）所获得的悬浮于生理盐水中的菌株，待紫花苜蓿生长至开花初期，对植物单株干重、结瘤率以及氮含量进行检测，以单株干重、结瘤率以及氮含量高为综合指标，筛选3-4株备选菌株；