[发明专利]红颈常室茧蜂特异性COI引物、含有其的试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及红颈常室茧蜂特异性COI引物、含有其的试剂盒及应用。

背景技术

绿盲蝽Apolygus lucorum(Meyer-Dür)属于同翅目盲蝽科，是我国各棉区的盲蝽优势种，现已上升为棉田主要害虫。对于绿盲蝽的防治，长期以来都未有十分有效的措施，一般是以化学农药防治为主。然而，随着农药的的使用，绿盲蝽抗药性不断增强，绿盲蝽的防治难度加大。寄生性天敌作为生物防治的手段之一，依靠寄生因子如毒液、多分DNA病毒、类病毒颗粒、类病毒纤丝、卵巢蛋白、畸形细胞极其分泌蛋白等方式影响寄主的生殖发育最终导致其死亡，在害虫控制方面发挥着积极重要的作用。

由于寄生蜂种类繁多复杂，且一般个体较小，从形态上较难鉴定区别。若想鉴定寄主体内未成熟发育阶段的寄生蜂，难度将更大。利用分子检测手段，不论是对寄生蜂个体，还是对寄生于寄主体内的寄生蜂，均可通过特异性引物扩增完成鉴定，这就大大的减轻了鉴定工作的强度和难度，节省时间，准确性高。

红颈常室茧蜂(Peristenus spretus Chen&van Achterberg)属膜翅目茧蜂科，是绿盲蝽若虫寄生蜂。由于寄生蜂在田间不易观察，且被寄生的绿盲蝽易在田间死亡等原因，一直无法对其与绿盲蝽的寄生关系进行更好的研究，鉴定工作也受到制约，无法准确评估红颈常室茧蜂对绿盲蝽的控制作用。本发明即提供了一种高效便捷的分子检测方法，利用特异性引物扩增有效鉴定红颈常室茧蜂，为准确评估红颈常室茧蜂对绿盲蝽生物防治效果提供有效手段支撑。

发明内容

本发明的目的是提供红颈常室茧蜂特异性COI引物、含有其的试剂盒及应用。

为了实现本发明目的，本发明根据红颈常室茧蜂的线粒体DNA序列，设计筛选得到一对红颈常室茧蜂特异性COI引物，其包括：

正向引物PsF1：5’-TATTAAGAAGAATAATTGGGATG-3’

反向引物PsR1：5’-ATTTAAATTTCGATCTGTTAATAAC-3’。

本发明还提供含有引物PsF1和PsR1的用于检测红颈常室茧蜂的试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液等中的至少一种。优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供所述引物PsF1和PsR1，以及含有引物PsF1和PsR1的试剂盒在检测红颈常室茧蜂中的应用。

本发明还提供一种红颈常室茧蜂的特异性快速PCR检测方法，包括以下步骤：

1)提取样品DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物PsF1和PsR1进行PCR扩增反应；

3)分析PCR产物。

PCR反应体系以20μL计为：

PCR反应条件为：94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40个循环。

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现大小为263bp的DNA扩增条带(SEQ ID No.3)，则判定样品为红颈常室茧蜂。

本发明的有益效果在于：

本发明设计一对特异性COI引物，该引物具有物种特异性，仅对红颈常室茧蜂具有扩增效果，扩增产物大小为263bp，灵敏度DNA浓度检出限为0.625ng/μL，而对其它物种包括其近源种、盲蝽属的其它盲蝽以及其他昆虫无扩增能力。

本发明在红颈常室茧蜂检测方面具有很高的价值，尤其当需要检测大量的样品量时，本发明不仅节省时间而且准确性高，在实际应用中具有重要的意义。本发明利用PCR检测技术，由特异性引物扩增得到特异性单一条带，操作简单，具有高效、价廉、特异性强的特点，提高了检测的准确性。

附图说明

图1为本发明实施例1中红颈常室茧蜂特异性引物PsF1和PsR1在各昆虫物种中的检测结果；其中“M”代表DNA Marker，“—”代表阴性对照。

图2为本发明实施例2中红颈常室茧蜂特异性引物PsF1和PsR1的DNA浓度梯度检测结果；其中，M：DNA Marker；1-14为模板DNA浓度依次2倍稀释浓度梯度；“—”为阴性对照。

具体实施方式