[发明专利]一种即时检测EGFR突变的微流控芯片

说明书

技术领域

本发明属于临床医学应用领域，涉及一种即时检测EGFR突变的微流控芯片。本发明的微流控芯片集核酸提取、LAMP扩增、即时检测为一体。

背景技术

肺癌已成为当前国内外公认的发病率第一、死亡率第一的恶性肿瘤。大量研究显示表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)作为受体酪氨酸超家族成员在多种恶性肿瘤中表达。配体与EGFR结合诱导形成二聚体，使构象发生变化活化酪氨酸激酶及信号转导途径，产生细胞增殖、侵润、转移及抗凋亡等效应。临床研究显示，EGFR激酶结构域的活化突变与药物敏感性相关，使得仅10％～30％患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂敏感，所以，检测EGFR基因突变有助于预测患者对药物的敏感性，筛查对靶向药敏感的人群，从而提高疗效，实现对患者的靶向个体化治疗。

肺癌的个体化治疗模式迫切需要一种能在患者旁边实现快速临床检测——即时检验(POCT)的装置。研究发现，EGFR酪氨酸激酶的突变主要发生在18-21外显子，其中19和21号外显子突变覆盖突变的90％。目前对EGFR突变的检测步骤包括标本获得、DNA抽提、EGFR突变检测和结果分析。检测的方法包括：DNA测序、ARMS及其它如DHPLC等。

随着等温扩增核酸技术(环介导等温扩增、解旋酶依赖的扩增、滚环扩增等)的兴起，为EGFR突变的POCT检测带来了新的契机。环介导等温扩增(LAMP)技术是2000年开始兴起的一个相对新的恒温基因扩增技术，它最突出的特点是高特异性、高敏感性、快速和高产出率。LAMP是在60-65℃执行的扩增技术，主要反应物是具有链置换活性的Bst DNA聚合酶和四条引物。一般在LAMP管中LAMP的阳性结果可通过浊度增加、发绿色荧光或者通过实时定量PCR仪检测。因此LAMP技术用于实时检测(POCT)方面的突出优势是不需要热循环仪器和结果的肉眼可视化。

世界卫生组织(WHO)做出了一系列适用于经济欠发达地区的一般诊断检测方法的方针，简称ASSURED：负担得起(affordable)、灵敏(sensitive)、特异(specific)、容易使用(user-friendly)、快速稳定(rapid and robust)、无需设备(equipment free)和可传送给终端使用者(deliverable to end users)。但是，聚合酶链反应(PCR)依赖精确的温度循环装置，此缺点导致PCR不便于成为POCT检测方法。后来，以恒温扩增核酸为基础的方法被证实有卓越的灵敏性和特异性但不算是负担得起、扩增速度较慢和需要较大的能量供应。在资源缺乏地区，微小化、无需大型仪器的LAMP系统在廉价实时检测(POCT)方面显示出了巨大的潜力。目前，微型LAMP系统在无需大型仪器(无需电泳仪等大型仪器)和操作方面还没有完全符合WHO所提出的标准。因此，目前在临床检测基因突变POCT化方面有强烈的需求。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种能够即时检测EGFR突变的微流控芯片。本发明的微流控芯片使得细胞或组织DNA的提取、扩增、目的序列基因突变的检测在一个微流控芯片中得以简便、快速、高效、无污染地实现。

本发明采用了如下技术方案：