[发明专利]烟草黑胫病菌和根黑腐病菌的双重PCR分子检测引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病虫害检疫领域，具体涉及一种烟草黑胫病菌和根黑腐病菌的双重PCR分子检测引物及检测方法。

背景技术

烟草是产量、质量并重，尤其重视质量的作物，而科学防治病虫害是保障烟草正常生长发育，实现优质、高产的关键。烟草黑胫病和根黑腐病(烟草两黑病)是世界性的病害，这两种病时常会相伴发生，一旦发病就会造成巨大的经济损失，在我国云南、贵州、湖北等主要产烟区发生较重，严重地块发病率可达30%以上。山东、河南、安徽、吉林、福建等产烟区也有发生，近年有加重危害的趋势。但是，烟草黑胫病菌和根黑腐病菌作为时常相伴发生的两种土传真菌，进行单一检测势必造成诸多麻烦，费工费时，目前对其双重检测还未见报道，更未形成特异性和高灵敏性体系。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种特异性和高灵敏性的烟草黑胫病菌和根黑腐病菌双重PCR分子检测引物，并提供了其检测方法，建立了特异性和高灵敏性的烟草两黑病菌双重PCR分子检测体系。

本发明通过以下技术方案实现：

设计一种烟草黑胫病菌和根黑腐病菌的双重PCR分子检测引物，包括以下引物对：

YYI-F：TCATTACCACACCTAAAAAACT，

YYI-R：ACTTTCGTCCCCACAGTATATT；

TB1419-F：GTGTTGGAGGACCCGCGTTTAG，

TB1419-R：AGTTGAGGGTTTTTCGGCATGTT。

设计一种烟草黑胫病菌和根黑腐病菌的双重PCR分子检测方法，包括以下步骤：

（1）提取待检测烟株、土壤或其混合材料中的总DNA；

（2）以所述总DNA为模板用权利要求1所述引物进行PCR扩增，采用20μL反应体系，其中包括：0.2μL的5u/μL rTaq酶，各0.4μL均为10μmol/L的YYI-F、YYI-R、TB1419-F和TB1419-R引物，1μL的总DNA，1.5μL的2.5mmol/L dNTP，1.0μL的2.5mmol/L MgCl₂溶液，2μL的10×PCR Buffer，余量为ddH₂O；PCR扩增程序：95℃预变性4min，35个循环的95℃变性30s、59℃退火50s和72℃延伸30s，最后在72℃延伸5min；

（3）取所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如在208bp处出现特异条带，说明待检测材料带有烟草黑胫病菌，反之则不携带；如在131bp处出现特异条带，说明待检测材料带有烟草根黑腐病菌，反之则不携带。

对于上述的双重PCR分子检测方法，所述总DNA浓度不小于50ng/μL。

本发明的积极有益效果：

（1）本发明在综合考量DNA序列的保守区、是否形成二级结构、G+C含量、碱基随机分布、长度、相似序列的干扰等众多因素的基础之上，并经过必要的修饰及大量的试验验证，最终设计并筛选出了特异性和高灵敏性的烟草黑胫病菌和根黑腐病菌双重PCR分子检测引物，并提供了其检测方法，建立了特异性和高灵敏性的烟草两黑病菌双重PCR分子检测体系，通过检测烟株病残体、土壤或其混合材料的全DNA序列，完成了烟草黑胫病菌和根黑腐病菌的快速准确超低浓度一次双重鉴定，并进一步实现了对不同耕作栽培条件下病害风险的精确预警性监测，显著提高了烟草双黑病的防治水平，满足烟叶生产上的迫切需求。

（2）本发明双重PCR分子检测可以以两对引物对两种目标模板同时进行反应，所以，对引物的设计要求较高，在两对引物之间不能形成稳定的二级结构，因此，引物的设计在保证引物扩增特异性和灵敏性的同时，还要符合双重PCR的条件。

（3）本发明所选作检测用的目标序列是烟草黑胫病菌的rDNA-ITS与烟草根黑腐病菌的rDNA-ITS序列，这两种病原菌的rDNA-ITS序列相似性极高，在设计引物时难度极大，本发明检测引物及检测体系克服了长期以来的因序列近似度高而难以进行双重PCR分子检测的技术难题。

附图说明

图1 本发明引物的特异性鉴定（一）琼脂糖凝胶电泳图；

图中 M为DL 2000 DNA Marker，1为烟草根黑腐病菌，2为烟草黑胫病菌，3为镰刀菌，4为烟草赤星病菌，5为烟草灰霉菌，6为正常烟叶，7为烟草角斑病菌，8为烟草蛙眼病菌，CK为ddH₂O空白对照，上述各病原菌的rDNA-ITS序列均有较高的相似性。