[发明专利]烟草根黑腐病菌的分子检测引物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病虫害检疫领域，具体涉及一种烟草根黑腐病菌的分子检测引物及其检测方法。

背景技术

烟草根黑腐病是世界性的病害，一旦发病就会造成巨大的经济损失，在我国云南、贵州、湖北等主要产烟区发生较重，严重地块发病率可达30%以上。山东、河南、安徽、吉林、福建等产烟区也有发生，近年有加重危害的趋势。但是，烟草根黑腐病菌作为烟草常见的一种土传真菌，目前对其检测还未形成特异性和高灵敏性体系。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种烟草根黑腐病菌的分子检测引物及其检测方法，设计了特异性和高灵敏性的检测引物，建立了烟草根黑腐病菌的PCR检测体系。

本发明通过以下技术方案实现：

设计一种烟草根黑腐病菌的分子检测引物，包括以下引物：

TB1419-F：GTGTTGGAGGACCCGCGTTTAG

TB1419-R：AGTTGAGGGTTTTTCGGCATGTT。

设计一种烟草根黑腐病菌的分子检测方法，包括以下步骤：

（1）提取待检测烟株、土壤或其混合材料中的总DNA；

（2）以所述总DNA为模板用上述引物对进行PCR扩增，采用20μL反应体系，其中包括：0.2μL的5u/μL rTaq酶，各0.4μL均为10μmol/L的TB1419-F和TB1419-R引物，1μL的总DNA，1.5μL的2.5mmol/L dNTP，1.0μL的2.5mmol/L MgCl₂溶液，2μL的10×PCR Buffer，余量为ddH₂O；PCR扩增程序：95℃预变性4min，35个循环的95℃变性30 s、59℃退火50 s和72℃延伸30 s，最后在72℃延伸5 min；

（3）取所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如在131bp处出现特异条带，说明待检测材料带有烟草根黑腐病菌，反之则不携带。

根据上述的分子检测方法，所述总DNA浓度不小于100fg/μL。

本发明的积极有益效果：

本发明在综合考量DNA序列的保守区、是否形成二级结构、G+C含量、碱基随机分布、长度等众多因素的基础之上，并经过必要的修饰及大量的试验验证，最终设计并筛选出了特异性和高灵敏性（达100fg/μL）的检测引物，建立了特异性和高灵敏度的PCR检测体系，通过检测烟株病残体和土壤的基因组序列，完成了烟草根黑腐病菌的快速准确超低浓度鉴定，并进一步实现了对不同耕作栽培条件下病害风险的精确预警性监测，显著提高了烟草根黑腐病害的防治水平，满足烟叶生产上的迫切需求。

附图说明

图1本发明引物的特异性鉴定琼脂糖凝胶电泳图；

图中 M DL2000 DNA Marker，1烟草根黑腐病菌，2烟草黑胫病菌，3镰刀菌，4烟草赤星病菌，5烟草灰霉菌，6烟叶，7烟草角斑病菌，8烟草蛙眼病菌。

图2本发明引物的灵敏性鉴定琼脂糖凝胶电泳图；

图中M DL2000 DNA Marker，CK ddH2O空白对照，9-16分别为基因组DNA浓度（104ng/μL）的1倍、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7倍。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种烟草根黑腐病菌的分子检测引物，引物对如下：

TB1419-F：GTGTTGGAGGACCCGCGTTTAG

TB1419-R：AGTTGAGGGTTTTTCGGCATGTT。

实施例2

一种烟叶中烟草根黑腐病菌的分子检测方法，包括以下步骤：

（1）提取待检测烟株烟叶部分的基因组DNA：

1）用无水乙醇先把研钵、研杵、镊子灼烧灭菌，冷却至室温，向研钵中加入液氮对研钵和研杵进行预冷，将装有烟叶的离心管放进液氮瓶中进行预冷，当研钵表面结出白霜即可用来研磨；

2）将离心管中的烟叶倒入研钵，向研钵中加入适量液氮快速、用力研磨，研磨过程中要不断添加液氮，研磨三次，研磨成均匀粉末状态后分装至1.5 mL离心管；