[发明专利]石榴同源四倍体的诱导方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物种质资源创新技术领域，尤其涉及一种石榴同源四倍体的诱导方法。

背景技术

石榴是世界上栽培较早的果树，有1000余个品种，在全球热带、亚热带区域种植分布广，具有较高经济价值、药用价值和观赏价值。近年来，国内通过杂交育种、芽变选育、实生选育、国外品种引种驯化选育出了不少优良石榴品种，实现保存石榴品种类型达到280余个。据研究现有栽培石榴为二倍体，体细胞染色体数目有2n＝2x＝18和2n＝2x＝16两种类型，而植物多倍化后，易出现营养和生殖器官的变大，次生代谢物含量的提高，抗逆性、抗病性的增强。因此，诱导培育出同源四倍体石榴，可以较大幅度提高石榴品质、抗逆性、抗病性及药用价值等。而目前的诱导操作方法繁琐，且诱导成功率不高。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术存在的缺陷，提供一种操作简单，诱导成功率高的石榴同源四倍体的诱导方法。

一种石榴同源四倍体的诱导方法，包括以下步骤：

(1)采收自交成熟的石榴果实，取其种子并用清水洗净晾干，将晾干种子置于4℃条件下处理4d，再放入27℃恒温箱催芽至萌动状态；

(2)将步骤1中萌动的石榴种子浸泡在质量百分比浓度为0.3％的秋水仙碱溶液里，然后将其置于25℃遮光恒温摇床上，以100r/min的速度振荡诱导培养24h，处理完后用自来水浸泡清洗3-5次，每次浸泡时间5min。

进一步地，如上所述的石榴同源四倍体的诱导方法，所述质量百分比浓度为0.3％的秋水仙碱溶液中添加有二甲基亚砜，二甲基亚砜在秋水仙碱溶液中的质量百分比浓度为1％。

进一步地，如上所述的石榴同源四倍体的诱导方法，在步骤1中进行催芽过程中，每天用清水清洗一次催芽种子以及催芽过程中用到的纱布。

进一步地，如上所述的石榴同源四倍体的诱导方法，在步骤1之前，还包括：按照石榴生长特性进行常规栽培管理，在石榴盛花期进行自花或同株异花人工授粉，授粉前后套透气纸袋隔离；精心管理授粉石榴树，防止落花落果；其中，石榴授粉时间选上午9:00—10:00。

进一步地，如上所述的石榴同源四倍体的诱导方法，在步骤2之后，还包括以下步骤：

(3)将诱变处理后的萌动石榴种子播种于消毒处理过的苗床或育苗盘，适时浇水和病虫害防治，待苗长出真叶后，每周喷洒1次1/2MS营养液叶面肥；

(4)多倍体流式细胞仪检测，取正常二倍体植株的嫩叶0.10g作为对照组，另分别取所有诱变处理植株的嫩叶各0.10g，然后将正常二倍体和所有诱变处理植株的嫩叶分别置于含1ml WPB缓冲液的培养皿中用刀片剁碎，2min后用300目尼龙网过滤，滤液加入50μl 10mg/ml DAPI，5min后用流式细胞仪检测，利用正常二倍体植株的嫩叶的滤液作为对照，筛选出叶片单细胞DNA含量为两倍于二倍体植株的变异株，将该变异株拟定为四倍体，并将其编号作为下一步植株染色数目检测材料；

(5)多倍体染色体数目观察：从拟定为四倍体的植株上剪取5-7cm长嫩枝，生根处理后扦插于沙床，扦插苗培育生根2周后，取其幼嫩根尖长2-3mm，用质量百分比浓度为0.1％的秋水仙碱溶液预处理4h，蒸馏水洗2-3次后，在4℃冰箱用卡诺氏固定液固定24h，4℃冰箱中保存备用，将根尖蒸馏水清洗，置于1mol/L HCl于60℃水浴中酸解8min，然后用改良苯酚品红染色压片法制备染色体标本，用显微镜观察染色体数目，选染色体数目为两倍于二倍体染色体数目的植株，确定为加倍成功的同源四倍体石榴。

进一步地，如上所述的石榴同源四倍体的诱导方法，步骤4之前，包括：提前镜检诱变材料气孔大小，筛选气孔大于二倍体的变异植株用于多倍体流式细胞仪检测。

进一步地，如上所述的石榴同源四倍体的诱导方法，步骤5中，根尖盐酸裂解后，放入蒸馏水中低压渗透20分钟，促使细胞染色体分散。

本发明克服一般倍性诱导方法操作繁琐的缺陷。诱导方法操作简易，诱导成功率高，满足多倍体选种之用，使多倍体育种成为石榴遗传改良、新品种培育的重要方法。

附图说明

图1为本发明实验例石榴二倍体染色体图；

图2为本发明实验例石榴四倍体染色体图。

具体实施方式