[发明专利]检测血清糖蛋白岩藻糖指数的化学发光蛋白芯片、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白检测技术，特别涉及一种检测血清糖蛋白岩藻糖指数的化学发光蛋白芯片及检测方法。

背景技术

原发性肝癌与肝炎、肝硬变等良性肝病产生的甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)在其糖链结构上存在很大差异，即与良性肝病相比，肝癌产生的AFP，其岩藻糖指数要高得多。岩藻糖具有与小扁豆素结合的特性。AFP根据其(岩藻糖基)对小扁豆凝集素的亲和力不同可以分为AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3。其中AFP-L1主要来自于良性肝病，AFP-L2主要来源于孕妇，而AFP–L3是甲胎蛋白的岩藻糖糖基化形式，主要来源于HCC。2005年FDA正式批准将AFP-L3作为原发性肝癌的标志物之一。AFP-L3在肝癌的早期诊断、鉴别诊断、疗效评估和预后监测等方面均具有较高的特异性与敏感性。

岩藻糖为甲基化六碳糖，存在于组织及血清多种糖蛋白糖链中，称为蛋白结合岩藻糖(protein-bound fucose,P-bf)。AFP碳水化合物链上存在岩藻糖残基，此种异质体称为岩藻糖基化AFP(FucAFP)，其占AFP总量的百分率称为岩藻糖基化指数(Fucosylation Index,Fuol)。岩藻糖基化指数具有重要的理论意义和临床应用意义，在肝癌诊断和预后应用中可以作为一项重要的指标。

传统的血清岩藻糖蛋白分离方法，包括亲和免疫交叉电泳技术，亲和印迹法，亲和层析法、“双位点夹心”酶联免疫吸附法、LiBASys测定仪、i30检测系统技术及热景生物糖基捕获离心柱前处理技术。其中植物凝集素亲和免疫电泳技术和i30检测系统技术要求高、操作繁琐、试剂昂贵，限制了其推广应用。而糖基捕获离心柱，由于样本处理和检测分开进行，增加了操作的繁琐性。

发明内容

本发明基于本领域在血清中AFP与AFP-L3的定量检测技术的需求及空白，提供了一种适合于定量检测生物样品中甲胎蛋白和/或岩藻糖基化甲胎蛋白的试剂盒及检测方法，该方案不仅仅适合于检测血清中的AFP抗原，对检测其他岩藻糖基化蛋白具有通用性，具有省时、经济、准确、便捷的优点。

本发明的技术方案如下：

一种检测血清糖蛋白岩藻糖指数的化学发光蛋白芯片，其特征在于：所述蛋白芯片的基质载片上至少包括一个检测亚区，一个所述检测亚区检测一份血清样品；

所检测亚区内设置有2个检测斑区域和1个排对照斑区域，其中一个检测斑区域有固定甲胎蛋白的特异性抗体形成的检测斑，另一个检测斑区域有固定小扁豆素形成的检测斑，所述对照斑区域有固定牛血清白蛋白形成的对照斑；

同一个检测斑区域内的所有检测斑上的物质的浓度相同。

所述一个检测斑区域至少包括两个所述检测斑。

所述甲胎蛋白的特异性抗体为鼠抗人甲胎蛋白抗体。

所述基质载片上具有多个所述检测亚区，所述每个检测斑区域包括排列成1排的4个检测斑，所述对照斑区域包括排列成1排的4个对照斑；所述检测斑和对照斑排成平行的三列。

所述检测亚区之间设置有凸起作为物理隔断。

一种检测血清糖蛋白岩藻糖指数的化学发光试剂盒，其特征在于：包括权利要求1～4任一所述的化学发光蛋白芯片。

还包括AFP标准品，生物素标记的AFP多克隆抗体，亲和素HRP和HRP化学发光底物液；所述生物素标记的AFP多克隆抗体为兔源抗体，与所述检测斑上固定的AFP特异性抗体来源于不同物种。

还包括用于洗涤和稀释的常规试剂PBST和PBS。

上述任一试剂盒在检测甲胎蛋白和/或岩藻糖基化甲胎蛋白和/或血清糖蛋白岩藻糖指数方面的应用。

一种定量检测岩藻糖基化蛋白的方法，其特征在于：采用上述任一化学发光蛋白芯片，包括如下步骤：

(1)样品检测

将待测血清样本稀释后滴加在所述化学发光蛋白芯片的检测亚区上，孵育后，用PBST洗涤检测亚区，去除非特异结合物；

加入用PBS稀释的生物素标记的AFP抗体,孵育后，用PBST洗涤，去除非特异结合物；

加入PBS稀释的亲和素HRP,孵育后，用PBST洗涤，去除非特异结合物。

加入HRP底物发光液，用化学发光扫描仪对蛋白芯片进行扫描，分别得到稀释后待测血清样本中的甲胎蛋白的发光像素值以及岩藻糖基化蛋白的发光像素值；

(2)获取甲胎蛋白标准曲线方程及岩藻糖基化蛋白的标准曲线方程：