[发明专利]固定化脂肪酶的制备方法

权利要求书

1.固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将菌种活化、培养后上罐发酵得游离酶液；所述菌种为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)CALB，已于2015年01月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为：CGMCC No.10277；

2)制备中空介孔SiO₂，具体方法如下：

将无水乙醇和去离子水混合，再加入氨水，混合后，加入TEOS，再离心收集白色沉淀，第1次洗涤和干燥，然后超声分散在去离子水中，加入CTAB溶液和Na₂CO₃，离心收集沉淀后，第2次洗涤和干燥，得到HMSS；所述无水乙醇、去离子水、氨水、TEOS、CTAB溶液和Na₂CO₃的配比为(25～30)ml∶(2～4)ml∶(1～2)ml∶(2～3)ml∶(3.5～4.5)ml∶(0.6～1)g，其中，无水乙醇、去离子水、氨水、TEOS、CTAB溶液以体积计算，Na₂CO₃以质量计算；

3)HMSS的改性

将HMSS超声分散在甲苯中，磁力搅拌、冷凝回流后，加入(EtO)₃SiPrCN，继续回流，离心收集产品，第1次洗涤和干燥后，得改性产物HMSS-CN；再将改性产物在硫酸中回流，离心收集产物，第2次洗涤和干燥后，得到产物，命名为HMSS-COOH；所述HMSS、甲苯、(EtO)₃SiPrCN的配比为(1～2)g∶(20～50)ml∶(110～150)μL，其中，HMSS以质量计算，甲苯、(EtO)₃SiPrCN以体积计算；

4)酶的固定化

将HMSS-COOH与游离酶液混合，在冰浴下搅拌，离心收集沉淀，并用磷酸钾缓冲液洗涤，冷冻干燥后，即得到固定化脂肪酶；所述HMSS-COOH与游离酶液的配比为(200～500)mg∶(10～30)ml，其中，HMSS-COOH以质量计算，游离酶液以体积计算。

2.如权利要求1所述固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述活化的方法为：从甘油管中接500～1000μL菌液到装有25mL YPD培养基的250mL的锥形瓶中，30℃、200rpm回转式摇床培养24～48h，转接一次；所述YPD培养基的组成为：10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖。

3.如权利要求1所述固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述培养的方法为：将活化后菌体按5％～10％的接种量接种到装有50mL BMGY培养基的500mL锥形瓶中，30℃、200rpm回转式摇床培养12～36h；所述BMGY培养基的组成为：10g/L酵母提取物，20g/L 蛋白胨，13.4g/L YNB，0.4mg/L生物素，10g/L甘油，1mol/L磷酸钾，pH6.0。

4.如权利要求1所述固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述上罐发酵的方法为：将种子液按5％～10％的接种量接种到BSM培养基中，发酵开始12h后，2～4h内流加50％甘油作为碳源，24h后，平均每24h补加80～160mL甲醇，诱导菌体产酶，120～144h后停止发酵，离心去菌体收集发酵上清液，获得游离酶液；所述BSM培养基的组成为：甘油40g/L，磷酸26.7mL/L，CaSO₄·2H₂O 0.93g/L，K₂SO₄ 18.2g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，PTM1 4mL/L，pH用氨水调为6.5。

5.如权利要求1所述固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述第1次洗涤和干燥的条件为：采用无水乙醇和去离子水各洗涤2次，再置于鼓风干燥箱内70～80℃干燥24h；所述超声分散的条件为将第1次干燥后的产物2g超声分散在350～400ml去离子水中；所述CTAB溶液的质量浓度为12.5mg/ml；所述第2次洗涤和干燥的条件为：用无水乙醇和去离子水各洗涤2次，放置鼓风干燥箱内70～80℃干燥24～48h。