[发明专利]单核增生李斯特菌和屎肠球菌双重PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明涉及单核增生李斯特菌和屎肠球菌的双重PCR检测试剂盒和应用试剂盒，该试剂盒检测单核增生李斯特菌hlyA的引物对以及屎肠球菌种ddl基因的引物，如在174bp和557bp处能得到特异性扩增条带，表示单核增生李斯特菌和屎肠球菌呈阳性，可同时检测单核增生李斯特菌和屎肠球菌，该方法的检测灵敏度的下限低于致病菌的最低感染剂量，这对后期的临床应用以及单核增生李斯特菌和屎肠球菌的监测具有重要意义。

技术领域

本发明涉及单核增生李斯特菌和屎肠球菌试剂盒，属于动物疫病分子生物学检测方法及检测试剂领域，具体涉及一种用于同步进行单核增生李斯特菌和屎肠球菌的双重PCR检测试剂盒和应用试剂盒对单核增生李斯特菌和屎肠球菌进行双重PCR检测的生物学检测方法。

背景技术

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种能引起人兽共患李斯特菌病的兼性胞内寄生菌，其引起的动物李斯特菌病引起猪、绵羊、牛、家兔发生脑膜脑炎、流产和急性败血病。肠球菌(Enterococci)属于人畜体内的正常菌群，也是重要的条件致病性病原菌。在肠球菌引起的感染病例中，屎肠球菌(Enterococcus faecium)引起感染的比例逐年升高。由于屎肠球菌对多种常用抗生素耐药，由其引起的感染通常难以应对。绵羊羔羊脑炎是目前我国羊场发生频率高，危害较为严重的一类传染病，给养羊业造成严重的经济损失。近期，从内蒙古部分羊场羔羊脑炎死亡病例分离得到的病原菌中，主要以单核细胞增生性李斯特菌和屎肠球菌为主。致病菌的感染剂量都不同，据报道称，大多数致病菌的感染剂量都大于10⁵CFU/mL。因此，寻求这两种病原菌快速简便的检测方法，对该地区有效的预防和控制疾病的发生有着重要的意义。

目前，针对单核细胞增生性李斯特菌和屎肠球菌，尚无可以同时检测这两种病原的PCR方法的报道。本发明建立了一种可以同时检测这两种病原的双重PCR方法，从而为本地区在生产中快速特异性检测这两种病原及其感染的鉴别诊断和流行病学调查提供新的方法。

发明内容

本发明经过多次筛选及鉴定，利用针对这两种菌特定基因的两对特异性引物，建立了一种能够同时检测单核增生李斯特菌和屎肠球菌的双重PCR方法。结果显示，所建立的方法具有良好的特异性和敏感性，可用于后期临床样本的检测。

本发明的目的是提供一种可用于同时检测单核增生李斯特菌和屎肠球菌的双重PCR检测试剂盒及检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：单核增生李斯特菌和屎肠球菌在同一PCR反应体系中进行特异性扩增，采用单核增生李斯特菌和屎肠球菌双重PCR检测引物组，包括检测单核增生李斯特菌hlyA的引物对以及屎肠球菌种ddl基因的引物对，序列分别如下：hlyA的引物对：上游引物组LM-F(SEQ ID NO:1)、下游引物组LM-R(SEQ ID NO:2)；ddl基因的引物对：上游引物组FM-F(SEQ ID NO:3)、下游引物组EFM-R(SEQ ID NO:4)。

作为一个具体的技术方案，本发明涉及单核增生李斯特菌和屎肠球菌双重PCR检测试剂盒，其特征在于，其包含上述的双重PCR检测引物组。

优选的是，单核增生李斯特菌和屎肠球菌双重PCR试剂盒具体包括：2x Es TaqMasterMix12.5μL，DNA模板2μL，引物各0.25μL，使用前用灭菌去离子水补足至25μL。

作为一个优选的技术方案，上述引物组可用于制备用于检测羔羊脑炎的试剂盒。

作为一个具体的技术方案，本发明还涉及采用试剂盒进行单核增生李斯特菌和屎肠球菌双重PCR检测方法，步骤如下：制备待测样品核酸模板，采用引物对核酸模板进行PCR扩增检测，在172bp和561bp处能得到特异性扩增条带，表示单核增生李斯特菌和屎肠球菌呈阳性；在这两位置处无可见扩增带，表示单核增生李斯特菌和屎肠球菌呈阴性。

优选的是，双重PCR检测方法以优化后的47℃为退火温度。