[发明专利]一种基于分子识别的荧光检测叶酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于食品检测领域，尤其是涉及一种基于分子识别的荧光检测叶酸的方法。

背景技术

叶酸是维持生物体正常生命活动过程必不可少的一类有机物质，需求量虽少，但是对维持健康意义重大。叶酸作为一种辅酶，在细胞分裂和生长，以及嘌呤、嘧啶、核酸、蛋白质的生物合成上发挥着重要的作用，在治疗某些肿瘤和心血管疾病方面也有一定作用。叶酸缺乏，容易导致生理功能退化及某些疾病如胃肠功能紊乱、智力退化以及神经管畸形的发生。处于发育期的机体、孕妇、哺乳期妇女、婴儿更加需要补充叶酸；对于巨幼红血球性贫血，叶酸是一种具有显著疗效的药物。

由于叶酸具有特殊的生理功能，特别是对妊娠期、哺乳期妇女和胎儿，叶酸经常作为营养强化剂用于保健食品及配方食品中。因此，如何测定这些食品中的叶酸含量，以监控这些食品的质量就变得尤为重要。

测定叶酸的分析方法主要有流动注射-化学发光法，高效液相色谱法，分光光度法，微生物法以及荧光光度法。经典的微生物法检测叶酸虽然灵敏度高，结果准确，但是操作繁琐，重复性差，实验周期长，容易受到广泛使用的抗生素的影响，检测结果不能区分各种叶酸盐形式。高效液相色谱法虽然在叶酸分析中应用广泛，但是方法都还不成熟。高效液相色谱法分离性能很好，但是仪器成本昂贵，同时使用大量有机试剂给环境造成严重污染。流动注射-化学发光法检测样品中叶酸含量，重现性较差。

三维荧光光谱技术是近几十年中发展起来的一种新的荧光分子技术，可以描绘荧光强度同时随激发波长和发射波长变化的关系图谱。拥有高灵敏度、高信息量和选择性的优势，广泛用作光谱指纹分析、临床分析、多组分分析等。当位于基态的荧光物质分子在吸收了与其相应的特征电子能级一致的光能后，其价电子将从成键或非成键轨道跃迁到反键轨道上去，这就是激发态产生的本质。处于激发态的分子，经振动弛豫和内部转换等非辐射的跃迁形式跃迁到第一激发单重态的最低振动能级，由此释放能量返回基态，所发射出的光辐射就是荧光。物质在一定频率和强度的激发光照射下，如果光被吸收的比例不太大且溶液的浓度非常小时(≤0.05)，则荧光物质的浓度与溶液所产生的荧光强度成正比。分子中至少具有一个芳环或具有多个共轭双键的有机化合物易于发射荧光，具有大的共轭Π键结构、给电子取代基和刚性的平面结构的分子可以发射强荧光。荧光法是分析药物和食品中各种维生素的较好方法，具有快速、灵敏、选择性好的优点。但是现有荧光分析法主要利用强氧化剂氧化叶酸，取得其分解产物产生的荧光，进行含量检测，操作起来比较费时费力，过程繁琐，另外由于叶酸的不完全分解会导致干扰较多，重现性差。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种在不破坏叶酸分子的前提下利用荧光光谱法快速、有效地检测叶酸含量的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于分子识别的荧光检测叶酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)合成识别分子：将乳清酸与1,12-二氨基十二烷水溶液混合，常温搅拌反应80～100小时得到混合液，将所述混合液除去水分得到浓缩产物，将所述浓缩产物用无水乙醇洗涤，真空干燥后得到1,12-二乳清酸基十二烷基二胺盐(DDO)，其反应方程式如下：

2)配制标准液：称取磷酸二氢钠和氢氧化钠溶于水，用盐酸调节其pH值为7.0～7.8，得到磷酸缓冲溶液；称取叶酸溶解于磷酸缓冲溶液中，得到叶酸标准溶液；称取DDO溶解于磷酸缓冲溶液中，得到DDO标准溶液；

3)测定三维荧光光谱特定条件：叶酸激发光波长为400nm，发射光波长为460nm；DDO激发光波长为320nm，发射光波长为390nm；

4)测定荧光强度：在DDO浓度为4.0×10^-4mol/L，激发光波长为320nm，发射光波长为390nm，激发电压为800V，激发光源透过孔径均为5.0nm，发射光源透过孔径均为5.0nm的条件下，改变叶酸的浓度，测定不同叶酸浓度下DDO溶液的荧光强度；

5)得出线性方程：根据步骤4)得出DDO溶液的荧光强度(F)与叶酸的浓度(cp)间具有线性关系，线性方程为F＝3116.99－28.4759cp，相关系数γ为0.9959，检出限为1.25×10^-6mol/L；

6)取1mL叶酸标准液，依步骤3)的方法测定荧光值，计算出叶酸的浓度。

进一步的，步骤1)中乳清酸与1,12-二氨基十二烷的摩尔比为2:1。

进一步的，步骤1)中反应时间为95～98小时。