[发明专利]一种检测水产植酸酶活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种检测水产植酸酶活性的方法。

背景技术

植酸酶是能够依次分解植酸分子中的磷，将植酸(盐)降解为肌醇和无机磷，同时释放出与植酸(盐)结合的其它营养物质的一类酶的总称。由于植酸酶能够分解饲料的植酸为肌醇和无机磷，提高饲料中磷的利用率，减少无机磷的用量，降低植酸及其植酸盐对蛋白质、矿质元素的螯合作用，提高饲料中营养物质的利用率，并减少植酸对动物肠胃内相关消化酶的活性的抑制作用，最终提高动物的生产性能，降低磷对环境的污染作用。自20世纪80年代开始在饲料中推广应用以来，已有2/3以上的畜禽饲料中都使用了植酸酶，其使用效果已得到广大从业人员的认可。由于水产养殖动物在生理上和饲料上的复杂性与特殊性，长期以来植酸酶在水产饲料中的研究与应用进展较为缓慢，但磷酸二氢钙是不可再生资源，随着其日益开采，其产量会越来越低，价格势必会不断上涨，这定会加速水产饲料中植酸酶使用的进程。此外，水产养殖中磷污染的日益加重，低污染养殖的呼声也越来越高，这也会进一步地推动植酸酶在水产饲料中的应用。

植酸酶活性的测定方法最常用的是分光光度法，其原理是在一定温度和pH条件下，植酸酶可将底物植酸钠水解，生成正磷酸和肌醇衍生物，并在酸性溶液中与钒钼酸铵生成黄色的复合物，于波长415nm下进行比色测定。目前已形成国标GB/T18634-2009《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》，其酶活定义为：在pH 5.50、温度37℃下，每分钟催化5.0mmol/L植酸钠溶液水解释放1μmol无机磷所需的酶量即为一个植酸酶活性单位，即该方法的检测标准是pH 5.50、温度37℃，只适用于检测在畜禽饲料中使用的酸性植酸酶，而不适用于检测在水产饲料中使用的植酸酶。因此，目前急需开发一种检测应用于水产饲料植酸酶活性的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测水产植酸酶活性的方法。

根据本发明的检测水产植酸酶活性的方法包括以下步骤：

(1)酶制剂待测样液的制备

称取水产植酸酶样品，加入0.1mol/L pH值至6.5的Bis-Tris缓冲液，制备浓度0.03～0.06U/ml的酶制剂待测样液制备；

(2)制备底物溶液：7.5mmol/L pH6.5的植酸钠溶液；

(3)反应

向比色管中加入酶制剂待测样液和底物溶液，25℃下反应；

(4)吸光值测定

将反应后的样液混匀，在分光光度计415nm波长处，测定对照管A₀和样品管A的吸光值，A-A ₀为实测吸光值，用直线回归方程计算无机磷含量，根据无机磷含量计算植酸酶活性；

(5)结果计算

样品中植酸酶活性以Y表示，单位为酶活性单位每克U/g或酶活性单位每毫升U/ml，按下式计算：

Y＝(C×n)÷(m×30)

式中：C表示由实测吸光值代入直线回归方程计算的无机磷含量；

n为水产植酸酶样品反应前总稀释倍数；

m为水产植酸酶样品的量，单位为g或ml。

根据本发明的方法，使用在近中性环境有很好缓冲能力的Bis-Tris缓冲液，以确保水产植酸酶活性是在近中性条件下测定的，保证测定结果的准确性。

根据本发明的方法，对于饲料样品中植酸酶活性的测定，使用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液来提取，可以降低饲料样品中可溶解的无机磷含量，从而减少对酶活测定的干扰，减小测定误差。

根据本发明的方法，通过减小待测样液的浓度，加大反应体系中样液的加样体积，可以减小测定误差。

根据本发明的具体实施方式，检测水产植酸酶活性的方法，包括如下步骤：

1溶液配制

1.1Bis-Tris缓冲液(0.1mol/L)：称取20.92g Bis-Tris，0.0167g牛血清白蛋白于1000ml烧杯中，加入900ml蒸馏水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至6.50，转移至1000ml容量瓶中并用蒸馏水定容至刻度；

1.2碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(0.1mol/L)：分别配制0.1mol/L的碳酸钠和碳酸氢钠溶液，按碳酸钠与碳酸氢钠溶液体积比为9:1的比例混合；