[发明专利]一种过表达c2orf68基因质粒构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体为一种能过表达c2orf68基因表达的真核重组质粒，以及利用该重组过表达质粒研究c2orf68功能提供了良好工具，也为研究人肝癌、人结直肠癌及其它恶性肿瘤中c2orf68基因的功能提供有效实验方法。

背景技术

肝细胞癌（hepatoceLLuLar carcinoma,HCC），简称人肝癌， 在世界范围内是第五位最常见的癌症，也是死亡率最高的癌症之一。在我国每年因人肝癌死亡的人数超过30万，仅次于肺癌，位居我国恶性肿瘤死亡率的第二位。结直肠腺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，近年来，其发病率逐年攀升，占所有恶性肿瘤的第二位。在欧洲，结直肠腺癌占恶性肿瘤相关致死病因的第二位。在中国的一些大城市，结直肠癌的发病率也达到所有恶性肿瘤发病率的2到5位。由于大多数恶性肿瘤具有特殊的生物学特性，早期诊断困难，易于发生转移，手术切除后易复发，所以远期治疗效果不佳。恶性肿瘤的早期发生的分子机制尚未完全阐明，因此深入了解癌症发生的分子机理，对于研究开发癌症早期诊断治疗有重要作用。

基因工程，又称为基因重组技术，是二十世纪七十年代发展起来的在体外对DNA进行操作的一门技术，广泛用于疾病基础研究、基因治疗、基因免疫、基因疫苗等。其三要素分别为：酶、目的基因、载体。而真核表达载体是基因工程中用于构建真核基因表达系统的一种载体，近几十年来，各国学者围绕真核表达载体进行了各种疾病、基因等相关研究，在基因工程方面做了大量工作，为医学科学研究开辟了崭新途径。c2orf68 基因编码的蛋白C2ORF68 中，含一个126 个氨基酸的UPF0561 结构域，属于UPF0561 蛋白家族。迄今为止，尚无任何关于UPF0561蛋白家族的功能报道。

因此，本发明运用基因重组技术，针对c2orf68基因，构建重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-c2orf68，并将其转染低表达或不表达c2orf68的肝癌、结直肠癌等恶性肿瘤细胞，构建稳定转染c2orf68基因的细胞株，为研究c2orf68功能提供了良好工具，亦为进一步研究c2orf68基因在肝癌、结直肠癌等恶性肿瘤中的生物学功能打下基础，同时也为研究人肝癌、人结直肠癌及其它恶性肿瘤中c2orf68基因的功能提供有效实验方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的真核重组质粒及其制备方法，并证明所述重组质粒为c2orf68功能研究提供了良好的实验工具，也为研究人肝癌、人结直肠癌等及其它恶性肿瘤中c2orf68基因的功能提供有效实验方法。

人c2orf68基因已在GenBank注册，注册号NM_001013649.3，定位于2p11.2，全长4283bp，编码166个氨基酸，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所述。人c2orf68基因的组织表达谱分析显示：该基因在人结直肠癌等胃肠肿瘤中均有表达。本发明所述的真核重组质粒，由序列表SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列中的CY- c2orf68片段与真核载体构建而成，所述CY- c2orf68片段是起始密码子下游73bp~573bp的核苷酸序列。

本发明所述的真核重组质粒，其制备方法依次包括以下的步骤：

（1）通过半巢式PCR合成人的CY- c2orf68基因片段；

（2）将上述获得的核苷酸片段与真核质粒连接，该插入片段的酶切位点分别为XhoⅠ和EcoRⅠ，再将所述真核重组质粒转化到感受态细菌细胞中进行培养，然后筛选出正确插入的真核重组质粒的克隆；

（3）使用碱裂解法抽提真核重组质粒，利用限制性内切酶酶切图谱分析所建的真核重组质粒，并进行DNA序列分析。

（4）将上述获得的重组质粒转染SMMC7721人肝癌细胞、及LoVo人结直肠癌细胞，观察细胞生物学特性。

（5） 实验表明，将所述重组质粒转染入人肝癌及人结直肠癌细胞，重组质粒作用于人c2orf68基因可导致结人肝癌细胞的增殖，因此，本发明有助于研究c2orf68基因功能，并且为研究c2orf68基因在人肝癌及人结直肠癌中发病的作用提供了有用分子生物学工具 。

附图说明

图1为本发明真核重组载体pcDNA3.1(+)的结构示意图。