[发明专利]一种用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物、探针和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物、探针和试剂盒。

背景技术

碳青霉烯类抗生素抗菌谱广，抗菌活性强，杀菌作用快。碳青霉烯类抗生素一直以来是治疗肺炎克雷伯菌等肠杆菌科细菌感染最有效的抗生素。近年来碳青霉烯水解酶的出现使得碳青霉烯类抗生素的耐药现象日趋严重，其中最典型的就是KPC(Klebsiella pneumoniae carbapenemases，肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶)的产生是目前引起肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。

随着肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的感染率逐渐上升，临床上采用改良的Hodge实验进行检测，但是该方法的假阳性率较高，而当肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶低水平表达时又会产生假阴性。

发明内容

为了解决现有技术检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶不准确的问题，本发明实施例提供了一种用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物、探针和试剂盒。所述技术方案如下：

一方面，本发明实施例提供了一种用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物和探针，所述引物和探针包括：用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物、用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的反向引物和用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的探针，其中，

所述用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；

所述用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；

所述用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；

所述探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，所述探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

另一方面，本发明实施例提供了一种用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物和探针。

具体地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。

具体地，所述工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作标准品4，其中，

所述工作标准品1为1×10⁷拷贝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段；

所述工作标准品2为1×10⁶拷贝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段；

所述工作标准品3为1×10⁵拷贝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段；

所述工作标准品4为1×10⁴拷贝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段。

具体地，所述阳性质控品为1.0×10⁶拷贝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段。

具体地，所述正向引物和所述反向引物的终浓度均为0.05-0.9μM，所述探针的终浓度为0.05-0.9μM。

具体地，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中包括：终浓度为0.01U/μL～0.05U/μL的Taq酶、终浓度为0.2～0.6mM的dNTPs、10×PCR缓冲液和终浓度为1.5～5.0mM的含Mg离子的溶液。

具体地，所述核酸释放剂包括无菌水、终浓度为0.03-0.3％的聚乙二醇辛基苯基醚、终浓度为0.04-0.4％的壬基酚聚氧乙烯(40)醚和pH值为8.3的终浓度为0.01-0.1M的三(羟甲基)氨基甲烷。

具体地，所述临界阳性质控品为1.0×10⁴拷贝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段。

具体地，所述阴性质控品为浓度0.8％的生理盐水。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物和探针，该引物和探针具有灵敏度高的特性，使得本发明实施例提供的用于检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的试剂盒，也具有灵敏度高的特性，该试剂盒采用仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，其检测结果可靠，提高了检测的灵敏度，即使仅存在单拷贝的目的片段该试剂盒也可以进行有效的检测。

附图说明