[发明专利]咔唑类比率型pH荧光探针及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及荧光探针，具体属于咔唑类比率发射型pH荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

细胞内pH在调控细胞、酶和组织功能中发挥着重要的作用。不同的原核生物以及真核细胞的不同亚细胞器内的pH值从碱性到强酸性不等。pH异常会导致细胞功能紊乱，严重时会引发诸如炎症、癌症和阿尔茨海默症等。因此，对细胞内pH进行灵敏、准确的实时监测，可以为分子水平上研究细胞的生理和毒理过程提供重要的信息。

在检测细胞内pH的众多方法中，荧光分析法具有非破坏性、高灵敏性、响应速度快、高信噪比以及能够连续检测pH变化的快速动力学过程等特性。此外，结合激光共聚焦显微镜，荧光成像技术成为分子水平上进行实时原位监测细胞内pH的重要手段。其中，比率荧光分析技术通过同时记录两个不同波长的荧光强度，并计算它们的比值可以有效地避免探针浓度负染不均，温度，设备以及细胞自发荧光的影响，从而达到对分析物精确的定量分析和荧光成像。迄今为止，文献报道了许多性能优异的比率型pH荧光探针，但该类探针大多数适用于弱酸性亚细胞器(如：溶酶体和内涵体，pH 4.0-5.5)和近中性细胞质(pH 6.8-7.4)内pH的检测。遗憾的是，对于极度酸性(pH<4)环境pH荧光探针的研发缺乏关注，导致这方面的pH荧光探针种类十分有限。虽然对于大多数生物来说，极度酸性是致命的，但是大量的微生物包括“嗜酸菌”和幽门螺杆菌已经进化到可以在这种极度酸性条件下存活。还有肠道致病菌，它能够经过哺乳动物极度酸性的胃液(pH 0.9-1.5)到达小肠，引起致命的感染。这就迫切需要开发有效的比率型极度酸性pH荧光探针，并且兼具大的Stokes位移，高的灵敏性、良好的选择性、光稳定性以及低毒性等特性，应用于细胞及大肠杆菌内极度酸性的检测。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种咔唑类比率型pH荧光探针；目的之二是提供该探针的制备方法，该方法工艺简单、成本低廉；目的之三是提供该探针的用途，即在检测细胞内酸性pH变化中的应用，以及在检测大肠杆菌内极度酸性pH变化中的应用。该探针对H⁺有高的灵敏度和选择性，且对pH变化的检测表现为成比率发射，并具有大的Stokes位移，能够有效减小激发光和细胞或生物样品自身荧光的干扰。

本发明提供的一种咔唑类比率型pH荧光探针，其结构式为：

其中，R₁、R₂为甲基或乙基；R₃至R₁₀、R₁₂至R₁₆为氢原子或甲基；R₁₁为氢原子、甲基、乙基或丙基。

本发明提供的一种咔唑类比率型pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

a.在惰性气体保护下，将N-乙基咔唑-3-甲醛或其衍生物和1,1-二烷基-2-甲基-1H-苯并[e]吲哚类衍生物按照摩尔比6-7:5溶于无水乙醇，以哌啶为催化剂，回流12-18小时后，将反应液冷却至室温，倒入大量的蒸馏水中，用二氯甲烷溶剂萃取，减压蒸馏除去有机溶剂，制得产物粗品；其中，无水乙醇、催化剂和蒸馏水的体积比为15-20:1:150-200；

b.将产物粗品浓缩后，经硅胶柱分离得到纯品。

其合成路线如下：

本发明的探针具有很好的细胞膜通透性，可用于细胞和大肠杆菌极度酸性pH变化的检测。