[发明专利]以2-Cys Prx为靶点的抗植物线虫侵染化合物的筛选方法

说明书

一种以2‑Cys型过氧化物还原酶为靶点的抗植物线虫侵染化合物的筛选方法，该方法包括构建含马铃薯腐烂茎线虫2‑Cys Prx基因的重组表达质粒pET41b‑DdPrx；将重组表达质粒转入BL21(DE3)感受态细胞，通过IPTG诱导培养以稳定表达重组Dd‑PRX蛋白；将候选化合物与重组DdPrx蛋白共孵育，根据硫氰酸铁法检测候选化合物是否对重组DdPrx蛋白具有离体抑制活性。本方法具有直接、简便、快速等优点，既可用于手工筛选，又可用于大规模高通量抑制剂的筛选。本方法能用于研发筛选抗植物线虫侵染药物。

技术领域

本发明涉及植物寄生线虫杀虫剂领域，具体涉及以2-Cys型过氧化物还原酶(Peroxiredoxins,Prx)即2-Cys Prx为靶点的抗植物线虫侵染化合物的筛选方法。

背景技术

植物寄生线虫是引起植物病害的重要病原物之一。在全球范围内，植物病原线虫的发生与危害随着农林业的发展和耕作栽培制度的演化而日益严重，已成为农业生物灾害中继昆虫、植物病害之后的第三大灾害。据报道，严重危害我国农、林、经济作物等的线虫达100多种。植物寄生线虫每年对全世界农作物的产量损失大约为1250亿美元。目前防治线虫的方法主要是通过栽培技术、作物轮作、抗性品种的选择，结合使用一些现在仍批准使用的化学杀线虫剂。

杀线虫剂是伴随着线虫危害的日益严重而诞生的，虽然这些化学药剂对线虫防治起到了积极作用，但我国现有防治线虫病害的药剂品种少，可供选择性不强，有关杀线虫剂的研究和开发，无论是理论研究和技术开发上，都还是农药领域中非常薄弱的部分，杀线虫的活性成分和作用机制方面研究较少。因为环境压力，植物寄生线虫的化学防治方法的发展受到严峻的挑战。开发新型、低毒、高效杀线虫剂势在必行。植物线虫抗氧化系统机制的深入研究为药物靶点的开发和利用提供了理论依据和新的切入点。

生物在有氧代谢过程中普遍产生活性氧(reactiveoxygen species,ROS)，为了抵抗ROS的损伤，生物在长期的进化过程中，形成了谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxudase,GPx)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化物还原酶(peroxiredoxins,Prxs)等各种抗氧化系统。为及时清除过多的内源性活性氧族及其周围环境包括寄主产生的外源性ROS的损害，植物线虫体内同样也存在各种抗氧化系统，使之维持在一个正常的水平。例如，在植物病原物侵染寄主过程中，植物通过产生过氧化物来抵御病原物的入侵，线虫等病原物则通过分泌抗氧化酶来清除其毒害。

作为抗氧化酶家族中的一员，过氧化物还原酶基因广泛存在于原核生物和真核生物中。目前已发现的Prx功能除了保持ROS平衡，使机体免受DNA损伤，蛋白变性及脂类过氧化等伤害外，还参与细胞凋亡、增殖、分化、细胞内信号传递以及基因表达调控等多种生物功能。随着对Prxs研究的不断深入，将Prxs作为潜在的药物、疫苗或诊断靶标正受到越来越多的关注和研究。

近年来对Prxs应用的研究主要集中在药物、疫苗或诊断目标三个方面，其中以Prx作为抗原进行疫苗研制及Prx与肿瘤的关系方面研究较多。在以Prx作为抗原的研究中，国外更是已有相关专利的报道，如，马来丝虫(Brugia malayi)Prx6作为疫苗抗原已经申请美国专利(U.S.Patent 6,352,836)；杜氏利什曼原虫(L.donovani)Prx1a作为一种疫苗抗原候选物已经申请了美国专利(U.S.Patent 7795406)，而以Prx为靶标进行防治植物线虫药物研制的报道目前还比较少。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种用于以2-Cys型过氧化物还原酶为靶点进行抗植物线虫侵染化合物筛选的重组表达质粒，该重组表达质粒为pET41b-DdPrx。

本发明同时提供一种以2-Cys型过氧化物还原酶为靶点的抗植物线虫侵染化合物的筛选方法，该方法包括如下步骤：