[发明专利]一种用于对虾细胞的启动子

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学重组表达技术领域，具体涉及一种用于对虾细胞的启动子。

背景技术

对虾病毒病的频繁爆发一直是困扰对虾养殖业并亟待解决的一个难题，而对虾永生性细胞系是分离和纯化对虾病毒、研究病毒的致病机理、发展有效的诊断试剂和防控技术以及生产高效的病毒疫苗等的有利工具和研究手段。尽管国内外专家学者在对虾细胞的体外培养和建系上进行了大量的探索和不懈的努力，但目前对虾的细胞培养仍然处于原代培养水平，永生性的细胞系一直未能成功建立。

对虾细胞建系失败的主要原因是体外培养对虾细胞的有丝分裂相极低，甚至不分裂。已有人尝试电离辐射和化学诱变剂处理，以及将对虾细胞与肿瘤细胞融合，向培养基中添加各种生长因子，等等，试图诱导对虾细胞永生性转化，但都没有成功。由于在哺乳动物细胞中，人们可以通过过表达癌基因和细胞周期调控相关基因，成功诱导细胞发生永生性转化。因此，1995年，Tapay等首次尝试将猿猴病毒40(SV40)大T抗原基因(SV40T)转染到南美蓝对虾(Penaeus stylirostris)原代培养类淋巴细胞中，虽然观察到细胞变圆，贴壁不紧，生长速度变快等转化特征，但未能成功得到永生性对虾细胞系。随后，Claydon和Owens(2008)又尝试将病毒(papillomavirus，HPV)癌基因E6and E7转染到小龙虾(Chrtax quadricarinatus)血细胞中，也未获成功。Hu等(2008，2010)又利用逆转录病毒载体介导SV40T基因在中国对虾原代培养类淋巴细胞和卵巢细胞中的基因转染。Shike等(2000)又检测了4种哺乳动物来源启动子在驱动荧光素酶报告基因在对虾细胞中表达上的活性，这4个启动子包括热休克蛋白70(hsp70)、杆状病毒早期基因启动子(IE-1)、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)和鸟劳氏肉瘤病毒(RSV)长末端重复序列(LTR)启动子。

遗憾的是，以上研究最后都没有成功实现对虾细胞的永生性转化。失败的主要原因可能与其采用哺乳动物来源基因和启动子，导致在对虾细胞中不亲和以及表达效率低有关。体外培养对虾细胞难以被转染，外源基因的整合与表达效率低，是与其细胞分裂不活跃有关(Dean等，2005)。这可能也是导致哺乳动物来源的许多强启动子在对虾细胞中活性低甚至无活性的主要原因。由此，有必要提供一种有效的适用于对虾细胞的启动子。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于对虾细胞的启动子，用于对虾细胞的转染，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种用于在对虾细胞中表达的启动子，该启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

为了提供在对虾细胞中的表达效率，对筛选得到的核苷酸序列为SEQ ID NO:1对虾细胞的启动子进行了改造，改造后的启动子的序列为SEQ ID NO:4；

上述的启动子和改造后的启动子可插入到真核细胞启动子后面，构成了复合启动子；

作为实施例的优选，所述的真核细胞启动子为细胞肥大病毒CMV基因启动子；其组成的复合启动子的序列为SEQ ID NO:3；或SEQ ID NO:5；

本发明的启动子用于构建真核表达载体，该表达载体可使外源目的基因在对虾细胞中高效表达。

本发明进一步提供了一种在对虾细胞中表达外源基因的方法，是用上述表达载体将外源目的基因导入对虾细胞中。

因为对虾细胞不分裂，难以转染，故验证所构建表达质粒是否能正确表达存在困难。而使用本发明的启动子构建的表达载体则可以很好地解决此问题。当此载体的外源基因是报告基因或含有报告基因的融合蛋白时，该载体可通过在哺乳动物细胞中的报告基因表达来验证其质粒构建的成功与否，然后将构建成功的质粒用于对虾细胞转染，提高对虾细胞转染成功率，减少对虾细胞原代培养物的浪费，节约时间和成本，从而弥补现有技术的不足。

附图说明

图1：凡纳滨对虾翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因的启动子(Lv-P_tctp)和编码区序列的PCR扩增及其序列测定结果；

其中：A图为TCTP基因编码区序列的RT-PCR扩增结果；B图为Lv-P_tctp启动子的PCR扩增结果；C图为Lv-P_tctp启动子序列(1-605)和TCTP基因编码区序列(606-1108)，下划线标出启动子中可能的转录因子结合位点，方框标出起始密码子，星号标出终止密码子；