[发明专利]一种流感病毒表面生物矿化的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及流感病毒的改造，具体涉及一种流感病毒表面生物矿化的方法。

背景技术

疫苗在预防传染病流行方面发挥了重要作用。由于大部分疫苗对热敏感，而疫苗的冷藏运输又很难得到保证，因此疫苗接种缺乏现象在许多发展中国家较为普遍。据估算，冷藏运输往往能占到疫苗成本的80％，并且还不能保证冷藏的效果。采用生物矿化技术，可在不影响疫苗效果的前提下，显著提高疫苗对热等外部环境的耐受性，解决疫苗冷冻运输和长期保存的问题。

近年来流感疫情频发，包括2009年的甲型H1N1流感大流行和2013年的H7N9流感疫情，另外，流感病毒每年都会以季节性流感病毒的形式在世界范围内广泛流行，不仅对公共卫生健康构成持续性危害，还给社会造成巨大的经济损失。所以，研究出一种生物矿化型的流感病毒，并将其应用到流感疫苗中具有重要的意义。

发明内容

为了克服流感病毒疫苗常温保存的问题，本发明的目的在于提供一种流感病毒表面生物矿化的方法。采用生物矿化的方法，在流感病毒表面形成磷酸钙的外壳，增加其热稳定性，使之在常温条件下可以长时间保存。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种流感病毒表面生物矿化的方法为在流感病毒的血凝素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)基因上插入内源性矿化基因，使流感病毒能够表达内源性磷酸钙生物矿化肽，通过该肽段，流感病毒可以在生理条件下自发形成蛋壳样外壳来保护流感病毒。

优选的，所述的内源性矿化基因为W6p或Nwp，其中，W6p基因编码的磷酸钙生物矿化肽的氨基酸序列为：RWRLEGTDDKEEPESQRRIGRFG(SEQ ID NO.1)，W6p基因的核苷酸序列优选为：

AGATGGAGATTGGAAGGAACAGATGATAAAGAAGAACCAGAAAGTCAAAGAAGAATTGGAAGATTCGGA(SEQ ID NO.2)；

Nwp基因编码的磷酸钙生物矿化肽的氨基酸序列为：DSSEEKFLRRIGRFG(SEQ ID NO.3)，Nwp基因的核苷酸序列优选为：

GATAGTAGTGAAGAAAAATTTTTGAGAAGAATTGGAAGATTTGGA(SEQ ID NO.4)。

矿化基因W6p或Nwp在HA或NA基因上插入的位置为：HA基因的290位氨基酸和291位氨基酸之间，NA基因的237位氨基酸和238位氨基酸之间。

一种生物矿化型的流感病毒，通过上述方法采用反向遗传学技术得到。

本发明通过采用基因工程技术对流感病毒进行改造，使其携带可以实现生物矿化的仿生肽，进而可以提高流感病毒的耐热性和免疫原性。

本发明的有益效果是：通过本发明可以提高流感病毒灭活疫苗和弱毒疫苗的耐热性和免疫原性，可降低流感疫苗对冷链运输和冰柜保存的要求，减少流感疫苗运输和保存成本，延长流感疫苗保存的有效期。

附图说明

图1是在流感病毒HA基因上插入两个矿化基因W6p和Nwp的示意图，图中所示为氨基酸序列。

图2是在流感病毒NA基因上插入两个矿化基因W6p和Nwp的示意图，图中所示为氨基酸序列。

图3是NA基因上插入矿化基因W6p的流感病毒RT-PCR鉴定结果图；其中，泳道1：DL2000，泳道2-4：拯救的携带W6p基因的生物矿化型流感病毒盲传第一、二、三代，5：阴性对照，6：PBD-NA-W6p质粒。

图4是NA基因上插入矿化基因W6p的流感病毒NA基因测序结果图，C1、C2、C3分别为盲传第一、二、三代病毒。

图5是H1N1亚型流感病毒液灭活后NA基因的PCR检测结果图；其中，泳道1：DL2000，2-7：灭活5min、10min、15min、30min、1h、2h的病毒液。

图6是NA基因上插入矿化基因W6p的流感病毒液灭活后NA基因的PCR检测结果图；其中，泳道1：DL2000，2-7：灭活5min、10min、15min、30min、1h、2h的病毒液。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述。应理解，下面的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。