[发明专利]一种动脉粥样硬化抑制剂筛选方法的建立

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种动脉粥样硬化抑制剂的筛选方法。一种血清淀粉样P蛋白(serum amyloid P component，SAP)及高密度脂蛋白(HDL)，建立SAP与HDL结合的Elisa方法，并用此方法在FDA化合物库中筛选出了能够抑制SAP与HDL结合的小分子化合物Hit-3(Benserazide hydrochloride-3)。

背景技术

心血管疾病目前已成为严重威胁人类健康的一大杀手，而动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是众多心血管疾病中的一种，同时也是很多其他心脑血管疾病的病理基础，它能引发血栓，心肌梗死，冠心病等，因此防治动脉粥样硬化发生和发展已成为当前研究的热点。迄今为止，尚没有有效的抗动脉粥样硬化药物。因此对动脉粥样硬化机制的深入研究及基于机制的抗动脉粥样硬化药物的开发对人类心血管健康具有重大意义。

动脉粥样硬化的发生是基于多种因素的共同作用，而在众多因素中，血浆高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)是其中非常重要的一种。如何提高HDL-C水平，直接影响到动脉粥样硬化的防治效果。但HDL是一个大分子量的蛋白质，直接作为药物干预治疗，其静脉注射量很大，长期大量注射很难实现，所以还没有被广泛应用，因此提高内源性HDL是防治As方法中更有前途的方法。

血清淀粉样P蛋白(serum amyloid P component，SAP)，主要由肝细胞合成。在炎症刺激物的诱导下，比如脂多糖LPS、白介素IL-1、IL-6等，SAP的浓度会显著性升高，从几倍到几百倍不等，提示SAP与心血管事件的潜在联系。研究发现临床动脉粥样硬化患者的粥样斑块中有SAP，而且与AS的严重程度呈正相关，证明了SAP与AS之间可能存在的联系。

SAP被报道与HDL结合，SAP缺失后的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化症状减轻，而且血清HDL浓度有显著提高。以上研究提示SAP促进动脉粥样硬化的形成。为此我们设计并建立SAP与HDL结合的Elisa方法，并用此方法在FDA化合物库中筛选能够抑制SAP与HDL结合的小分子化合物。此研究符合我国药物现代化的发展方向，在基础研究领域和应用研究领域内具有重要的社会意义和潜在的经济效益。

发明内容

采用实验室制备的SAP，进行生物素标记，获得SAP-Biotin。设计并建立SAP与HDL结合的Elisa方法，并用此方法在FDA化合物库中筛选，Hit-3(Benserazide hydrochloride-3)能够显著抑制SAP与HDL结合，且半数抑制浓度(IC₅₀)为4.8μM。

下面是部分试验及结果：

一、建立下列Elisa方法

以HDL包被ELISA板，4℃过夜，用封闭液封闭，37℃孵育2h，加上述方法制备的SAP-Biotin，37℃孵育2h后，加AB试剂，37℃孵育1h，加入TMB显色液，显色5～10min后加终止液(2mol H₂SO₄)，酶标仪450nm测吸光度。根据有无HDL包被吸收值的差异，确定方法的可行性。有无HDL包被吸收值有极显著性差异，说明Elisa方法建立成功。所有数据统计学差异采用Student’s t-test进行分析。P＜0.01为有极显著性差异。结果见表1。

表1有无HDL包被吸收值

^##与无HDL包被组比较p＜0.01

二、采用上述建立的方法初步筛选化合物库

以HDL包被ELISA板，4℃过夜，用封闭液封闭，37℃孵育2h，加上述方法制备的SAP-Biotin(加一定浓度的待筛化合物)，37℃孵育2h后，加AB试剂，37℃孵育1h，加入TMB显色液，显色5～10min后加终止液(2mol H₂SO4)，酶标仪450nm测吸光度。根据吸收值的大小，确定哪些化合物有抑制HDL及SAP结合的作用。结果我们从FDA化合物库中通过高通量筛选，找出几个苗头化合物(hits)，通过再次验证，确定Hit-3为先导化合物(lead)，如图1。

三、小分子抑制剂的剂量依赖性测定

以HDL包被ELISA板，封闭后加SAP-Biotin孵育，之后加AB试剂孵育，TMB显色液，测定小分子化合物对SAP与HDL结合抑制的作用。结果先导化合物Hit-3呈浓度依赖性抑制SAP-Biotin与HDL结合，半数抑制浓度(IC₅₀)为4.8μM，如图2。