[发明专利]一种PSA启动子介导荧光素酶基因表达的质粒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种PSA启动子介导荧光素酶基因表达的质粒。

背景技术

前列腺癌是男性生殖系统的恶性肿瘤之一，主要发生在西方发达国家的老年人当中，近年来在我国的发病率呈现上升趋势。前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA）是前列腺上皮细胞分泌的一种特异蛋白，它在血清中含量的变化可以反应前列腺癌的发生、发展、侵袭转移和预后等情况，目前主要作为前列腺癌临床诊断、治疗及判断预后主要敏感指标。PSA主要存在于前列腺细胞与组织中，正常情况下血清中含量较低，当患有前列腺癌时，由于肿瘤细胞的大量增殖及破裂，PSA被大量释放入血，使得血清中PSA含量大幅升高，因此临床上以PSA浓度的异常升高作为诊断前列腺癌的一个重要依据。前列腺上皮细胞特异性的表达PSA，因此检测前列腺上皮细胞内PSA的表达改变水平，可以更方便、准确和直观的反应前列腺癌疾病的进展、侵袭转移及预后等。

荧光素酶作为一种常用的信号分子，目前被广泛地用于标记组织及细胞。与基于荧光素酶的生物发光技术在体内检测的灵敏度更高，在动物体内能检测到10²数量级的细胞，而荧光成像技术只能检测到约10⁶数量级的细胞。荧光素酶标记的肿瘤细胞经皮下、静脉或原位接种在动物体内成瘤后，借助于活体成像系统，通过检测荧光素酶的生物发光强度，可以间接反映出肿瘤生长的大小和肿瘤转移位置。

发明内容

本发明提供一种PSA启动子介导荧光素酶基因表达的质粒，该质粒由pPSA-ZsGreen显性骨架和荧光素酶Firefly Luciferase基因片段连接而成。将该质粒转染入前列腺癌细胞，为构建前列腺癌的PSA荧光报告基因小鼠模型奠定基础。通过荧光定位前列腺癌小鼠模型中肿瘤的部位，可为前列腺癌的治疗和新型药物的研发提供一个可靠的动物模型。

附图说明

图1是以前列腺癌LNCaP细胞株基因组DNA为模板，通过PCR扩增PSA启动子序列；

图2是pPSA-FL-Luc质粒的构建，（A）pZsGreen1-1质粒的图谱，（B）pPSA-FL-Luc质粒构建电泳结果：a、PSA-FL-Luc重组质粒；b、pPSA-FL-Luc酶切产物；c、DL5000 Marker；d、FL-Luc 的PCR扩增产物；

图3是不同浓度双氢睾酮对pPSA-FL-Luc报告质粒荧光活性强度影响；

图4是经G418筛选2周后所得到的高发光强度的前列腺癌LNCaP细胞；

图5是活体荧光显像系统观察前列腺癌瘤体移植，（A）前列腺癌肿瘤原位模型（B）去势处理模型小鼠：a、未去势处理组；b、去势处理组。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的实质，本发明结合附图和实施例作进一步的说明。但这些具体实施方案不是要以任何方式限制所要求保护的发明范围。

实施例1

1. 细胞株及实验动物  人PCa细胞株LNCaP，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；人胚肾293T细胞株，由浙江省器官移植重点研究实验室保藏提供；SCID鼠购自斯莱克实验动物有限责任公司。

2. 主要试剂  RPMI-1640培养基，胎牛血清购自Gibco公司； pGL3-Basic Vector、pRL-TK Vector及Luciferase双荧光素酶报告基因试剂盒购自Promega公司；pZsGreen1-1 Vector购自clontech公司；BCA蛋白定量试剂盒，RIPA蛋白裂解液购自碧云天公司；pMD 18-T Vector购自Takara公司；lipofectamine 2000购自invitrogen公司；抗生素G418购自Sigma公司；荧光素酶底物D-Luciferin购自Biotium公司。

3. 细胞培养  人PCa细胞株LNCaP较难培养，选用Croning公司的培养瓶和培养板，采用RPMI-1640培养基加10%胎牛血清，加常规青霉素、链霉素双抗，置于5% CO2、37℃恒温培养箱常规培养。