[发明专利]一种测定PD‑1通路抑制剂之生物学活性的方法

说明书

技术领域

一种用于测定PD-1通路抑制剂之生物学活性的方法，所述方法包括：将表达αCD3TM和PD-L1的靶细胞、表达NFAT报告基因和PD-1的效应细胞与PD-1通路抑制剂相接触，和测量NFAT报告基因的信号以测定PD-1通路抑制剂的生物学活性。

背景技术

程序性死亡受体1(PD-1)是首先在激活的T细胞和B细胞上表达的免疫抑制性受体。该受体与其配体的相互作用在体外和体内一直显示减弱的T细胞应答。阻断PD-1与其配体之一PD-L1间的相互作用显示提高肿瘤特异性CD8+T细胞的免疫性，因此，可有助于免疫系统清除肿瘤细胞。

PD-1(由基因Pdcd1编码)为与CD28和CTLA-4有关的免疫球蛋白超家族成员。业已显示PD-1当与其配体(PD-L1和/或PD-L2)结合时会负调节抗原受体信号转导。业已弄清鼠PD-1结构以及小鼠PD-1与人PD-L1的共结晶结构(Zhang，X等，Immunity 20：337-347(2004)；Lin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105：3011-6(2008))。PD-1及类似的家族成员为I型跨膜糖蛋白，其含有负责配体结合的Ig可变型(V-型)结构域和负责结合信号转导分子的胞质尾区。PD-1胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号转导模体ITIM(免疫受体酪氨酸抑制作用模体)和ITSM(免疫受体酪氨酸转换作用模体)。

在T细胞刺激后，PD-1将酪氨酸磷脂酶SHP-2募集到胞质尾区内的ITSM模体，这导致效应分子的去磷酸化作用，效应分子例如有CD3ζ、PKCθ和ZAP70，这些分子参与CD3T细胞信号转导级联。PD-1减量调节T细胞应答的机理与CTLA-4的相似，但又有所不同，因为这两种分子都调控重叠的一系列信号转导蛋白(Parry等，Mol.Cell Biol.25：9543-9553)。Bennett及合作者表明，仅当激活和抑制两种信号都在同一表面时，PD-1介导的对T细胞信号转导的抑制作用才会有效，这表明PD-1信号转导机制由时间及空间决定(Bennett F.等，J Immunol.170：711-8(2003))。

研究显示PD-1在激活的淋巴细胞(外周CD4+和CD8+T细胞、B细胞和单核细胞)上表达，并且还显示在胸腺发育期间在CD4-CD8-(双阴性)T细胞以及NK-T细胞上表达。

PD-1配体(PD-L1和PD-L2)为组成型表达，或在多种细胞类型中可被诱导，这些细胞类型包括非造血组织以及各种肿瘤类型。PD-L1在B细胞、T细胞、髓样细胞和树突状细胞(DC)上表达，但也在外周细胞(例如微血管内皮细胞)和非淋巴器官(如心脏、肺等)中表达。与此相反，PD-L2仅在巨噬细胞和DC中存在。PD-1配体的表达模式提示了PD-1在维持外周耐受中的作用，并且用于调节在外周中的自我活化的T细胞和B细胞应答。两种配体都为含有胞外区域中的IgV-样和IgC-样结构域的I型跨膜受体。两种配体都含有含未知信号转导模体的短胞质区。

迄今有大量的研究显示PD-1与其配体的相互作用在体外及体内导致抑制淋巴细胞增殖。业已显示破坏PD-1/PD-L1相互作用可增加T细胞增殖和细胞因子产生，并阻断细胞周期进展。最初对Pdcd1-/-小鼠的分析并没有鉴定任何明显的免疫学表型。然而，老龄小鼠自发发展了与Pdcd1缺陷回交株系不同的自身免疫疾病。这些疾病包括狼疮样增殖性关节炎(C57BL/6)(Nishimura H.等，Int.Immunol.10：1563-1572(1998))、致死性心肌病(BALB/c)(Nishimura H.等，Science 291：319-322(2001))和I型糖尿病(NOD)(Wang J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 102：11823-11828(2005))。总之，对敲除动物的分析使得清楚了PD-1主要起诱导并调节外周耐受的作用。因此，治疗性阻断PD-1途径可有助于克服免疫耐受。这种选择性阻断可用于治疗癌症或感染以及用于在接种(预防性或治疗性)期间加强免疫性。PD-1通路抑制剂在临床治疗上前景十分诱人。为了开发更多的PD-1通路抑制剂以及为了PD-1通路抑制剂(例如单克隆抗体)生产中的质量控制，有必要开发对PD-1通路抑制剂之生物学活性进行测定的方法。