[发明专利]鸭源性冠状病毒弱毒株DCV35的制备及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株鸭源性冠状病毒（Duck Coronaviruse, DCV）弱毒株DCV35的制备及应用，属于生物技术领域。

背景技术

鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）严重危害我国的养殖业，每年因鸡传染性支气管炎所导致的经济损失非常严重，而预防本病主要用的是弱毒疫苗，其中使用最为广泛的弱毒疫苗为H120和H52。但是由于IBV血清型众多，IBV基因组又容易变异，新的IB变异株不断出现，使得现有的疫苗对新出现的变异流行毒株不能产生有效的保护作用，导致IBV的防治变得困难。

IBV ZZ2004是从引起免疫抑制和生长抑制为主要症状的番鸭中分离到的一种病毒，该病毒能引起肉仔鸡发生类似的症状，发病率为80%，死亡率为10%以上，发病鸡群体重减轻37%左右，免疫力下降，经济损失达30%以上。鸭源性IBVZZ2004在致病性上与国内所报道的IBV存在明显的不同，引起显著的免疫抑制和生长抑制，且对鸡和鸭均能感染。IBVZZ2004毒株与国内流行的IBV亲缘性很低，与国内的主要疫苗株的亲缘性也很低，如M41株、H120、Beaudette、IBV4/91的同源性为85.2%~87.9%。该病毒分离株ZZ2004的分离和鉴定方法、致病性以及基因变异等相关特性都已经在发明专利ZL201010225577.4中有所展示，在生产实践中现有的疫苗对鸭源性IBVZZ2004不能产生有效的保护力，使得该病不断流行。从已获得研究资料看，鸭源性IBVZZ2004毒株的免疫原性良好，具备作为疫苗毒的基本要素。因此，有必要对其进行致弱研究，以期制备一株良好的弱毒株，为IBVZZ2004弱毒疫苗研发奠定基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是提供一种鸭源性冠状病毒弱毒株DCV35的制备方法，并对其基因特征以及在传染性支气管炎预防方面的应用进行研究。

为解决以上技术问题，本发明的内容为：鸭源性冠状病毒弱毒株DCV35的制备，其特征在于所选取的强毒为IBV ZZ2004第6代种毒，该强毒株已送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO.3842。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期 2010年4月29日，分类命名：鸭源性冠状病毒。

如上所述的鸭源性冠状病毒弱毒株DCV35的应用，鸭源性冠状病毒弱毒株的制备方法，其特征在于：将该鸡传染性支气管炎病毒ZZ2004第6代作为种子毒，经56℃水浴20min后，接种9日龄SPF鸡胚，每胚尿囊腔接种0.2mL，置于SPF鸡胚孵化器31-33℃孵育；弃去24小时之内死亡的鸡胚，72小时后选择典型病变鸡胚的尿囊液无菌收取病毒；再用前述方法作同样处理，进行传代，连续传至25代，从第26代开始采用37℃孵化培养，再连续传代至第35代，获得DCV35。上述的病毒S1基因具有明显的特征，病毒传至第22代时S1基因有12个碱基发生了变异，这种变异在传至第35代仍保持稳定。所述的该弱毒株苗能够诱导靶动物产生针对鸡传染性支气管炎病毒的特异性免疫应答，可预防该病的发生。

首先，种子病毒接种鸡胚前先经56℃水浴20min，接种SPF鸡胚后，进行31~33℃低温培养，再用前述方法做同样处理，连续传至第25代，从第26代开始采用37℃培养，再连续传代至第35代，获得致弱毒株DCV35。

其次，在传代过程中比较分析各代次病毒S1基因序列的变异情况，发现传至第22代时S1基因有12个碱基发生了变异，这种变异在传至第35代仍保持稳定。S1基因的12个变异位点分别是：188ntT→C（Val→Ala），191ntA→G(Asn→Ser)，228ntT→G(Asn→Lys)，232ntA→C (Ser→Arg)、347ntT→A(Phe→Try)、351ntG→T(Arg→Ser)、360nt T→G(Ser→Arg )、454ntG→A (Val r→Ile)、471ntT→G(Ser→Arg)、560ntC→A(Thr→Lys)、1477ntT→C(Ser→Pro)、1497ntA→C(Gln→His)。