[发明专利]一种中性内切葡聚糖酶及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种中性内切葡聚糖酶及其编码基因与应用。

背景技术

纤维素是植物纤维的主要成分，约占其干重的30～50％，是目前分布最广的天然碳水化合物，也是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。随着世界人口的激增、全球经济的飞速发展、粮食的短缺和石油、煤炭和天然气等不可再生资源正以惊人的速度减少，可再生纤维素资源的开发利用已引起全世界的普遍关注，成为世界各国研究的重大课题。纤维素酶的研究为此开辟了一条广阔的途径，特别是近10年来，随着现代生物技术迅速发展，基因重组技术及其一系列分子生物学技术的应用，使这一领域的研究更为深入，并在应用上将显示出其潜在的价值。

纤维素酶(cellulase)是降解天然纤维素生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称。所以，纤维素酶不是单一成分的酶，而是一组酶系的总称。目前根据其催化功能的不同，普遍认为纤维素酶可分为由三类不同水解功能的酶组成：内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶，β-葡萄糖苷酶。

I、内切型葡萄糖苷酶(endo-1,4-β-D glucanase，EC3.2.1.4，简称EBG)，也称Cx酶、CMC酶、EG。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性术端的小分子纤维素；

II、外切型葡萄糖苷酶(exo-1,4-β-D glucanase，EC3.2.1.91)，也称C1酶、微品纤维素酶、纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，简称CBH)，这类酶从纤维长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子；

III、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21，简称BG)又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生成葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快，随着葡萄糖聚合度的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。

纤维素的降解必须依靠三种组分的协同作用才能完成。外切β-葡聚糖苷酶从纤维索的非还原多聚体末端水解1,4-β-糖苷键，将天然纤维素分解为直链纤维素，使其转变成水合非结晶纤维素；内切β-葡聚糖苷酶则水解纤维素的内在糖苷键，将直链纤维素内部切断，分解为纤维二糖和纤维寡糖；而β-葡萄糖苷酶则将纤维二糖分解成两个葡萄糖单位。

内切葡聚糖酶可以分为三种类型：酸性内切葡聚糖酶(最适pH3～5)、中性内切葡聚糖酶(最适pH6～8)和碱性内切葡聚糖酶(最适pH8～10)。酸性纤维素酶主要用于棉及其混纺织物的生物抛光整理上。而中性纤维素酶主要用于牛仔布及其服装的洗旧石磨处理上。碱性纤维素酶主要家用洗涤剂中，可增强洗涤剂的去污能力，经常使用还可改善织物的表面特性。

酸性内切葡聚糖酶主要由丝状真菌产生，其产生菌主要包括里氏木霉、康宁木霉、黑曲霉等。酸性内切葡聚糖酶研究再早，但随着工业应用范围的不断扩展和应用研究的不断深入，酸性葡聚糖酶也显现出诸多不足。如中碱性条件下酶活性较低或根本没有活性、稳定性差、pH值食用范围窄，而且在酸性条件下处理纺织品后会产生褪色现象等，这极大限制了内切葡聚糖酶在碱性洗涤剂、纺织品酶洗整理等工业中的应用。因此，寻找新型、高效、稳定和pH值适应范围更广的内切葡聚糖酶意义重大。

由细菌产生的内切葡聚糖酶主要是中性和碱性内切葡聚糖酶，在中性和碱性条件下均具有一定的酶活性及稳定性。与真菌产生的酸性内切葡聚糖酶相比，由细菌产生的中性和碱性内切葡聚糖酶具有其共同而独特的优越性：(1)pH值适应范围广，一般在pH值6-10之间均具有较高的酶活性；(2)稳定性好，可以耐受60℃的高温；(3)酶成分单一，主要酶活性成分为内切葡聚糖酶，便于工业应用；(4)可用细菌发酵生产，发酵周期短；(5)可以承受很高的pH值，作为洗涤用酶可使衣物经过多次洗涤后手感、外观等保持鲜艳；(6)可以在中性环境中处理纺织品，不会造成纺织品褪色等。可见，对于条件要求甚高的洗涤和纺织工业用酶，细菌产中性纤维素酶有比传统酸性纤维素酶更好的优越性。因此，寻找新的具有优良性质的中性纤维素酶对我国造纸工业的可持续发展具有重要意义。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种中性内切葡聚糖酶H31基因的核苷酸序列及其氨基酸序列。本发明根据内切葡聚糖酶保守序列设计简并引物，用PCR的方法成功克隆出中性内切葡聚糖酶基因。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述含信号肽编码序列的H31基因的表达载体。