[发明专利]一种基于光诱导电子转移筛选G‑四链体配体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外基于光诱导电子转移均相筛选G-四链体配体的方法，属于抗肿瘤药物筛选的技术领域。

背景技术

端粒酶以自身的RNA作为模板，在染色体末端合成端粒序列，以保持染色体末端端粒长度稳定，从而使细胞永生化。研究发现，端粒酶在85％以上的癌症细胞中呈阳性表达，而在正常体细胞中几乎没有表达，并且，肿瘤细胞分化程度与端粒酶的活性直接相关，这表明端粒酶与肿瘤细胞的恶性转化及快速增殖可能存在密切的关系(Shay J.W.,Wright W.E.Telomerase therapeutics for cancer:challenges and new directions[J].Nat.Rev.Drug Discov.2006,5:577–584.)，因此恶性肿瘤与端粒酶的活性之间具有高度的相关性。

富含G的端粒DNA单链在K⁺、Na⁺等离子以及一些药物分子的存在下可以通过G碱基之间的Hoogsteen环状氢键形成稳定的G-四链体结构(Hupper J.L.,Balasubramanian S.Prevalence of quadruplexes in the human genome[J].Nucleic.Acids.Res.2005,33(9):2908–2916.)。G-四链体的形成可以阻止端粒酶对端粒DNA序列的识别，从而抑制端粒酶的活性。端粒酶活性的抑制可使肿瘤细胞端粒缩短直至细胞停止增殖，转入细胞凋亡过程，从而抑制肿瘤的发展。因此这一发现使G-四链体成为端粒酶抑制剂作用的新靶点，对于能够诱导形成或增强G-四链体稳定性的小分子化合物则很有可能对癌症的治疗具有潜在的意义。

在已报道的研究工作中，X-射线衍射、表面等离子体子共振(SPR)、核磁共振(NMR)、圆二色性(CD)、凝胶电泳等多种分析方法被用来研究G-四链体。但是它们存在操作复杂，费时，成本较高等不足而使其较难实现高通量的筛选。为了克服这些缺点，不少研究工作者试图发展不同的检测途径，其中荧光光谱，特别是荧光共振能力转移途径，由于其优越的灵敏度以及信号转化的多元化而成为有利的检测途径。虽然取得的一定的研究成果，但是时常需要双标记，成本较高并且对染料有特殊的要求。鸟苷可以与多种荧光染料例如荧光素,香豆素,芘,罗丹明等,发生光诱导电子转移(photoinduced electron transfer,PIET)过程，结果表现为染料的荧光被猝灭。在此过程中,这些染料以它们的电子激发态作为电子受体,而鸟苷则扮演电子给体的作用。相对于FRET途径，其不需要标记特异性的染料，成本低廉，操作过程简单。目前为止，利用G碱基作为猝灭剂的分析已广泛应用于检测特定蛋白、DNA/RNA、金属离子和小分子、以及发生在寡核苷酸中点突变的检测，但是还没有报道将其应用于高通量的药物筛选方面。

每一个筛选模型由于自身分析技术的局限性和操作影响，都会造成数据波动误差。一般而言，系统越稳定，数据的波动性越小可靠性也越高。相反，则系统的可靠性低，不适用高通量药物筛选。Z因子是一个用于判断筛选模型稳定性的统计学参数，其公式为：

如果Z因子小于0.5，则说明分析条件还需要进一步优化，或者该检测形式无法得到有效的数据。如果Z因子大于等于0.5，说明系统有良好的稳定性，适用于高通量筛选。

此本发明基于PIET用G碱基代替荧光猝灭基团，利用探针分子与药物直接作用后发生构型转换所引起的信号变化，设计了响应快速、低成本的高通量筛选G-四链体配体的方法，可以简单、快速并有效的来筛选抗肿瘤药物。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种普适性强、成本低、易于推广能够实现高通量快速筛选的基于光诱导电子转移筛选G-四链体配体的方法。

本发明实现上述目的所采用的技术方案是由以下步骤组成：

(1)将发夹型DNA用20mmol/L pH＝7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液配制浓度为100μmol/L的发夹型DNA溶液，放于4℃以下保存；

(2)用20mmol/L pH＝7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液将步骤(1)的发夹型DNA溶液浓度从100μmol/L稀释成50nmol/L，取浓度为50nmol/L的发夹型DNA溶液加入96孔板中，测定初始荧光强度值；