[发明专利]用于检测青少年复发性呼吸道乳头瘤状病毒的试剂盒

说明书

技术领域

 本发明涉及一种病毒TapMan荧光定量检测试剂盒，确切讲是一种用于检测青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV11亚型一步法TapMan 荧光定量PCR检测试剂盒。

背景技术

青少年复发性呼吸道乳头瘤状瘤（juvenile-onset recurrent respiratory papilloma,JO-RRP）特指发生于上下呼吸道的乳头瘤病，是一种由乳头瘤状病毒（human papillomavirus,HPV）病毒引起的具有高度复发性及侵袭性的疾病，可以发生于呼吸道任何部位，其中最易累积与鳞状上皮与纤毛柱状上皮交界处。JORRP患者首发症状主要是声音嘶哑，首发年龄最小为两周，最大为14周岁，且病程表现多样，个别患儿可以自发缓解，多数则呈现侵润生长并需要多次手术甚至出现喉、气管狭窄梗阻窒息死亡，临床治疗十分棘手。

HPV属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是由8000个碱基组成的环状双链DNA病毒，约有200余中亚型。根据病毒的基因组结构、生物学特性和致病性，可分为五大类，即α、β、γ、μ和ν，低危型的HPV6和HPV11属于α乳头瘤病毒。低危型与青少年复发性呼吸道乳头瘤状瘤密切相关，国内外学者即已开展了相关的治疗研究，然而尚未建立有效的细胞培养模型或简便的病毒繁殖模型，难以进行传统的灭活疫苗或着监督疫苗的研制。

研究认为HPV的亚型与病情严重程度和临床经过相关，而且亚型之间存在毒力差异，因此临床上能够快速区分引起青少年复发性呼吸道乳头瘤状病毒HPV11亚型显得的尤为重要。常规PCR方法检测灵敏度不高，且易出现假阳性，已有的检测性病HPV11亚型的SYBR Green荧光法属于非饱和染料，不能完全饱和的嵌入DNA双链中，会造成检测结果的不准确。

发明内容

本发明提供一种对可用于检测青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV11亚型的高度特异性引物对及探针，以及包括有这一高度特异性引物对及探针的可特异、敏感、快速和便捷的用于定量检测青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV11亚型的试剂盒。

本发明的用于检测青少年复发性呼吸道乳头瘤状病毒的高度特异性引物对，其序列分别为SEQ ID No.1和 SEQ ID No.2。

本发明的用于检测青少年复发性呼吸道乳头瘤状病毒的试剂盒内包括的高度特异序列为 SEQ ID No.3的探针。为使用方便，本发明的试剂盒内还有2×One Step RT-PCR BufferⅢ、TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)和PrimeScript RT Enzyme MixⅡ等扩增所需要的所有实验试剂，检测时只需按照说明加入检测样品即可。

本发明的用于检测青少年复发性呼吸道乳头瘤状病毒的试剂盒内还含有作为阴性对照的不含青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV11亚型的DNA样品和作为阳性对照的含有青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV11亚型的DNA样品。

前述本发明的引物对优选扩增条件为： 95℃ 10sec，1个循环→95℃ 10sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec，40个循环。

本发明的试剂盒实际上是一种一步法TapMan 荧光定量PCR检测的试剂盒。一步法TapMan 荧光定量PCR检测是使用5`端带有荧光物质，3`端带有淬灭物质的TapMan探针进行荧光检测，当探针完整时，5`端荧光物质受到3`端淬灭物质的制约，不能发出荧光。而当TapMan探针被分解后，5`端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。在PCR反应中特异性探针和模板杂交，延伸是聚合酶活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度，从而可以达到检测PCR产物扩增量的目的。在PCR使用本试剂盒进行Real Time PCR反应可在同一反应管内连续进行，操作简单，并能有效防止污染。

利用本发明试剂盒进行青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV11亚型一步法TapMan荧光定量PCR检测，其优点在于，根据青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV11亚型流行株的L1基因保守涉及到两条高度特异性引物和探针，在该病毒DNA提取的基础上，对组织样品进行荧光定量PCR扩增，实现对青少年复发性呼吸道乳头瘤HPV11亚型的定量检测。

本发明用到的TaqMan探针法为针对青少年复发性呼吸道乳头瘤状病毒HPV11亚型特异的核苷酸序列设计的探针，探针与模板是高度特异性结合，特异性和敏感性均高。填补了临床上快速分型检测青少年复发性呼吸道乳头瘤状病毒HPV11亚型的空白。