[发明专利]转基因苜蓿草J101品系特异性环介导等温扩增检测用引物及检测方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种转基因苜蓿草J101品系特异性环介导等温扩增(LAMP)检测用引物及检测方法和应用。

背景技术

转基因苜蓿草J101品系由孟山都公司开发的耐除草剂的转基因品系，2005年美国和加拿大批准环境释放和作为饲料应用，目前还未获得我国转基因生物安全证书，尚未批准其进口。

转基因苜蓿通过饲料进入动物养殖的食物链，致使牛奶、肉等制品成为转基因食品，可能对于人的健康产生影响。根据《农业转基因生物安全管理条例》、《农业转基因生物进口安全评价管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》和《农业转基因生物标识管理办法》，凡是在中国境内销售的转基因生物，必须进行标识。对转基因产品标识需要检测方法的支撑。目前对转基因产品基于核酸基础上的检测可以分为4种检测策略:1)筛查法:对转基因产品中的启动子中的启动子、终止子等通用基因进行筛查；2)基因特异性检测：对转基因产品中的外源目的基因进行检测；3)构建特异性检测：对外源目的基因与启动子或终止子的特异连接序列进行检测；4)品系特异性/转化事件特异性检测:对外源片段与宿主基因组DNA特异连接序列进行检测。

由于启动子、终止子、目的基因可以有多种组合关系，同一组合转化同一植物也可产生不同转化事件，特别对于进境监管，同一种作物有些转基因品系是允许进口，而有些品系可能由于某种原因没有区得准入。因此筛查法、基因特异性检测和构建特异性检测具有局限性，不能完全满足转基因产品身份验证等检测、监测和安全管理的需求。而品系特异性/转化事件是指某个外源基因表达框(或片段)插入到宿主基因组某个位置而形成的稳定遗传转化。因此转化事件一旦发生就具有唯一性，针对转化事件的检测可以起到身份识别的作用。

2000年，Notomi等开发了环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，其原理是针对目的核酸片段的设计特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在约62℃进行等温扩增。该方法具有灵敏度高，特异性好，反应时间短，判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势。但是，针对不同的检测对象，引物的筛选以及针对性的扩增和检测条件是获得高灵敏度、高特异性结果的关键，对于同一种检测对象，采用不同的引物组合，其检测结果也相差甚远。目前未见到有转基因苜蓿草J101该作物品系特异性LAMP可视化检测方法相关文献报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有转基因苜蓿草采用的筛查检测技术不能准确地检测具体的转基因品系的不足，提供一组转基因苜蓿草J101品系特异性LAMP检测用引物，该组引物具有高特异性和灵敏度，基于所述引物及其组合，本发明可成功建立转基因苜蓿草J101品系特异性LAMP可视化检测方法。

本发明要解决的另一技术问题是提供转基因苜蓿草J101品系特异性LAMP可视化检测方法。

本发明还一要解决的技术问题是提供所述检测方法的应用。

本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明通过创造性地分析和大量实验研究总结，在转基因苜蓿草J163品系的3‘端外源插入片段E9 3与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列，结合序列信息的分析，设计得到一组共六条特异性的引物。并确定了精确地检测步骤和条件，建立特异性强、灵敏度高的转基因苜蓿草J101品系特异性LAMP可视化检测方法，满足转基因产品身份验证等检测、监测和安全管理的需求。

具体地，本发明提供一组转基因苜蓿草J101品系特异性LAMP检测用引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB，所述引物的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示：

SEQ ID NO.1：F3:5’-TTCCAGAATCCTTGTCAGATTC-3’。

SEQ ID NO.2：B3:5’-GCTGGAATTAGCAAGATAAG-3’。

SEQ ID NO.3：FIP:5’-ATCGATGCGGCCACCACTGACTTGCCAATTGATTGACAAC-3’。

SEQ ID NO.4：BIP:5’-CCCATTTGGACGTGAATGTAGATTAATGCATACGATCCGTCG-3’。

SEQ ID NO.5：LF:5’-GGCTGCAGGTCGATTGAT-3’。