[发明专利]一种检测细菌大环内酯类耐药基因的引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种检测细菌大环内酯类耐药基因的引物及试剂盒。

背景技术

大环内酯类抗生素是一类具有大环内酯环这一基本化学机构和相似抗菌谱的抗菌药物，可按组成大环内酯环的碳原子数进一步分为14、15、16元环大环内酯类抗生素。大环内酯类有第一代替代青霉素的红霉素等，第二代的克拉霉素，罗红霉素等。大环内酯类抗生素是一类快速抑菌剂。

大环内酯类抗生素对于细菌的作用主要是抑制细菌蛋白质的合成。研究表明：细菌核糖体的新生肽释放通道具有一定的保守性，不同种属细菌的核糖体50S亚基中，新生肽释放通道的大小和形状相差不大，而大环内酯类抗生素均可结合于新生肽释放通道的入口处，促使肽酰tRNA从核糖体上脱落，阻断肽链的衍生，从而抑制细菌蛋白质的合成，发挥抗菌活性。

大环内酯类抗生素对革兰氏阳性菌和某些阴性菌有较强的抗菌活性，对衣原体、支原体等微生物也有良好的效应，毒副作用和不良反应比氨基糖苷类、四环素类和多肽类抗菌药物低，并且没有β-内酰胺类抗菌药物的严重过敏反应，因此广泛的运用于细菌感染性疾病，且疗效也被肯定。主要用于耐青霉素的金黄色普通球菌及其他敏感菌如肺炎球菌等感染，对流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌，肺炎支原体等感染也有良好的疗效。大环内酯类抗生素在非感染性疾病治疗也有作用：如治疗自身免疫性血小板减少、恶性肿瘤、消化道出血、肝纤维华、缺铁性贫血、冠心病等疾病上的应用。

近30年来，由于大量抗生素在临床上的不合理应用，临床疾病相关细菌的耐药性不断增加，引起正常菌群失调和大量耐药菌株出现。耐药菌能够承受住抗生素药物的攻击，这样一来标准的治疗就失去了效果，感染持续存在并可传染他人。抗生素耐药性是由使用抗生素药物，特别是对抗生素药物的不当使用造成的，当细菌发生突变或获得耐药基因时，就产生了耐药性。大环内酯类药物在临床中的广泛应用使得越来越多的产生了对该类抗生素耐药的菌株，导致临床治疗失败。这就需要一种能方便快捷的检测细菌耐药性的方法，从而来及早发现耐药细菌，进而改变用药方案，指导临床治疗。

耐药性的检测可以分为常规表型检测(即药敏试验)和耐药基因型检测。常规药敏试验首先需要通过培养的方法从临床标本中分离到菌株，而许多生长较慢和不易培养的细菌，是无法通过常规药敏试验检测其耐药性的，哪怕是能快速增长的菌，表型检测还是需要较长的时间才能检测出来。在过去的2O年，为适应临床需要，以DNA探针和聚合酶链反应(PCR)为基础的分子手段检测耐药基因取得了很大进展，其中部分方法已被美国食品和药品管理局(FDA)批准用于临床工作。从最初的定性PCR和电泳到后期的基因芯片等技术都可以检测细菌抗生素相关耐药基因，但定性PCR及电泳法具有容易污染、操作繁琐等缺陷，基因芯片技术可同时检测多个耐药基因，但成本也非常高，操作复杂，所需时间长，不适宜临床大规模推广应用。

实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(或cDNA)进行定量检测的方法。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、成本低廉等特点。目前已有多种运用定量PCR技术的试剂盒应用于临床疾病相关的病原体检测、基因分型、突变研究等。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种灵敏、准确、操作简便的新型检测试剂盒，实现对常见细菌大环内酯类耐药基因ermA、ermB、ermC的快速检测，以弥补现有检测方法的不足。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

检测细菌大环内酯类耐药基因的引物，它包括如下引物对：

(1)扩增ermA耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示；

(2)扩增ermB耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示；

(3)扩增ermC耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示；

上述3对引物对在一次检测中共同使用。

上述检测细菌大环内酯类耐药基因的引物在制备细菌大环内酯类耐药基因检测试剂中的应用也在本发明的保护范围之内。