[发明专利]一种检测全血或血清样品中端粒酶的活性程度的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测全血或血清样品中端粒酶的活性程度的试剂盒。

背景技术

端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合体，具有逆转录酶的活性。其组分包括端粒酶RNA模板(human telomerase RNA,hTR)、端粒酶相关蛋白1(human telomerase associated protein1,hTEP1)以及端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)三个部分。研究表明，hTERT是端粒酶的核心，只表达于端粒酶阳性细胞，并且是端粒酶的限速因子，其mRNA表达水平直接决定端粒酶的活性程度。

人类正常体细胞一般无端粒酶活性，而85％～90％的恶性肿瘤可检出端粒酶活性。人类细胞在胚胎发育早期，端粒酶呈活化状态，随后被抑制并一直处于失活状态，因而体细胞通常无端粒酶活性或活性很低。当体细胞发生癌变时端粒酶再度活化，以逃避正常的细胞衰老过程，获得无限增殖的潜能。因而，端粒酶再活化是恶性肿瘤一个显著的生物学特征。可以通过检测hTERT mRNA的表达水平来确定端粒酶的活性程度，从而诊断待检者是否患有恶性肿瘤。

荧光定量PCR是一项通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板进行定量分析的检测技术。

但是，现有技术中这种检测方法还不完善，存在检测灵敏度低的缺点，常导致一部分患者漏诊，或者出现“假阳性”，给患者带来不便。因此，需要建立一种敏感性高、特异性好、适用面广的检测方法。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是，提供一种检测全血或血清样品中端粒酶的活性程度的试剂盒，可以准确检测待测样品中端粒酶的活性程度，从而克服现有技术的不足。

为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

检测端粒酶hTERT mRNA表达水平的引物，包括如下引物序列：

(1)端粒酶hTERT基因的引物序列：

SEQ ID NO:1(hTERT-F)：5’-GGCCGATTGTGAACATGGA-3’；

SEQ ID NO:2(hTERT-R)：5’-CCTCTTTTCTCTGCGGAACGT-3’；

(2)端粒酶hTERT基因的探针序列:

SEQ ID NO:3(hTERT-P)：5’-TACGTCGTGGGAGCCA-3’，且其5’端与荧光报告基因相连，3’端与荧光淬灭基因相连。

其中，端粒酶hTERT基因的探针序列5’端连接的荧光报告基团为FAM，3’端连接的荧光淬灭基团为MGB。

上述的检测端粒酶hTERT mRNA表达水平的引物在制备检测全血或血清样品中端粒酶的活性程度的试剂中的应用也在本发明的保护范围之内。

一种检测全血或血清样品中端粒酶的活性程度的试剂盒，该试剂盒包括上述端粒酶hTERT基因的引物(hTERT-F和hTERT-R)和端粒酶hTERT基因的探针(hTERT-P)。

其中，该试剂盒还包括如下试剂：总RNA提取试剂、反转录试剂、荧光定量PCR反应试剂、质控品。

其中，所述的总RNA提取试剂的包括如下试剂：

(1)细胞裂解液Trizol：体积分数为56％的重蒸苯酚，28.2g/L的异硫氰酸胍，14.9mmol/L柠檬酸钠溶液，3g/L十二烷基肌氨酸钠，醋酸钠112.7mmol/L，溶剂为双蒸水；

(2)萃取液：氯仿；

(3)沉淀剂：异丙醇；

(4)漂洗液：体积分数为75％的乙醇-；

(5)RNA溶剂：无RNA酶的水。

其中，所述的反转录试剂包括如下组分：

(1)逆转录反应缓冲液：250mmol/L Tris-cl，375mmol/L KCl，15mmol/L MgCl₂，50mmol/L DTT，pH8.3；

(2)dNTP混合物：10mmol/L dATP，10mmol/L dTTP，10mmol/L dCTP，10mmol/L dGTP；

(3)逆转录酶液：20mmol/L Tris-cl，200mmol/L NaCl，0.1mmol/L EDTA，1.0mmol/L DTT，体积分数为50％的甘油，200U/μL逆转录酶，40U/μL RNA酶抑制剂，pH7.5；