[发明专利]杀真菌素链霉菌恩拉霉素抗性好且产量高的基因和菌株

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物分子育种领域，建立在杀真菌素链霉菌中将rpsL基因定点改变，获得杀真菌素链霉菌恩拉霉素产量高的菌株。

背景技术

链霉菌在工业微生物中是一类极具商业价值的微生物。链霉菌是放线菌中重要的一个属，它产生大多数已知抗生素及其他生物活性物质，自然界约70％的抗生素是由链霉菌及其近缘放线菌产生的，它们分别在抗肿瘤、抗真菌、抗细菌及抗寄生虫等方面具有功效。例如：用于抗家畜寄生虫的阿维霉素和塞拉菌素、防止水稻紋枯萎的井冈霉素、用于医疗和兽药的红霉素泰乐霉素金霉素、用于动物生长促进剂的恩拉霉素黄霉素、用于植物保护的阿巴汀庆大霉素多氧霉素、用于抗肿瘤的链黑菌素柔毛霉素及用于免疫抑制剂的Fk506和雷帕霉素等。

链霉菌作为生物技术界瞩目的菌种资源，其育种和寻找新的链霉菌资源一直是活跃的领域。传统的菌株改良主要是使用物理化学随机诱导菌种突变以提高菌株的抗生素产量，或者用天然杂交或原生质体融合技术从突变筛选系的分支处组合预期基因以得到高产量或产新抗生素的菌株。虽然很多传统选育方法都取得了较大成功，但这些方法到目前还不能得到大家的满意。另外，这些方法存在很大的缺点，具有盲目性和筛选工作量大等劣势。随着分子生物学的不断发展，人们对链霉菌次级代谢产物合成基因及相关调控基因的研究，对链霉菌基因功能及相关调控基因认识不断深化，通过基因工程手段对菌株进行改造已经成为可能。

对链霉菌进行遗传操作，首先要建立方便快捷的操作方法，目前最常用的两种操作方法是原生质体转化和大肠杆菌-链霉菌间结合转移。原生质体转化方法由于步骤复杂，原生质体再生容易发生突变及再生困难等难题已经逐渐被结合转移法所取代。结合转移法受体链霉菌分为两种状态，包子热激发和菌丝体法。影响结合转移效率的因素主要是受体菌的状态和结合转移用的培养基。

通过基因工程手段对链霉菌进行改造，提高抗生素的产量，主要是通过对合成核糖体S12蛋白的基因rpsL进行定点突变，核糖体结构的改变带来了功能上的改变，调节链霉菌次级代谢产物代谢途径，这些结构的改变有的起正调节，有的起负调节作用，有的是多效性，有的是专一的。

而改变基因的方法可以通过基因置换来实现，其基本原理是基于染色体的同源重组，及作用基因置换的质粒上携带长度合适的基因片段，片段之间插入能在链霉菌中表达的抗性基因标记(如安普霉素)，同时载体部分也含有在链霉菌中表达的抗性标记(如卡那霉素和氯霉素)。基因置换是在抗生素的选择压力下，以单拷贝或低拷贝的形式进行的，因此质粒在受体菌中一般是不复制。质粒通常采用的形式有几种，如只在大肠杆菌中复制的单功能载体、温敏型质粒或复制及稳定功能有缺陷的质粒。当质粒转入受体菌时，可通过单抗或双抗筛选获得发生单交换的转化子，质粒这时通过与染色体上同源片段之间的重组而整合到染色体上。将上述转化子在松弛条件下生长一代或几代，可大大提高二次交换发生的频率，然后通过影印或者点种在两种不同抗生素平板上，挑取只对插入抗性标记敏感的转化子即可能为发生基因置换的菌株。

采用rpsL基因的定点突变已经在天蓝色链霉菌和变铅青链霉菌得到应用，而且其次子代谢产量也巨大的提高。目前文献中，还没有利用该基因突变提高杀真菌素链霉菌恩拉霉素产量的报道。

本发明的工作是在恩拉霉素生产菌株杀真菌素链霉菌中进行的。利用核糖体工程对其进行改造没有相关的研究，通过引物PCR扩增杀真菌素链霉菌基因组DNA，获得rpsL基因并对其进行点突变。

发明内容

本发明的目的在于提供一种杀真菌素链霉菌恩拉霉素产量高的菌株，本发明的目的在于通过基因工程手段来提高杀真菌素链霉菌恩拉霉素产量,该方法是分子生物学方法的一种,通过点突变杀真菌素链霉菌染色体上的rpsL基因,达到提高恩拉霉素产量的目的。

本发明的目的是这样实现的：

一种杀真菌素链霉菌恩拉霉素抗性好且产量高的基因，序列如序列1所示。

一种含有如权利要求所述的杀真菌素链霉菌恩拉霉素抗性好且产量高的基因的基因工程菌。

而且，所述工程菌的宿主菌为含有pUZ8002质粒的大肠杆菌ET12567感受态细胞。

而且，所述载体为pKC1139。

本发明的优点和积极效果是：

本发明建立了杀真菌素链霉菌方便快捷的遗传操作方法,克服了物理化学诱变的育目性和工程浩大的筛选工作，利用定点突变的方法改变在链霉菌中存在的编码表达核糖体S12蛋白基因,提高恩拉霉素生产菌株的产量。