[发明专利]一种靶向鼠T淋巴细胞CD3和人肿瘤抗原HER2的双特异性抗体制备方法及应用

权利要求书

1.一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括连接的A部分和B部分；

其中，A部分包括识别效应细胞表面触发分子的片段，所述细胞表面触发分子选自小鼠的CD3，A部分为ScFv-Fc形式，包括抗-mCD3VH、VL、Fc结构域，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；以及

B部分包括识别靶细胞表面标志分子的片段，靶细胞表面标志分子选自HER2/neu，B部分为IgG形式，包括抗-HER2重链与轻链，其重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

A部分包括效应细胞表面触发分子的抗体片段和人IgG1Fc；B部分包括靶细胞表面标志分子的抗体重链和轻链，所述靶细胞表面标志分子的抗体重链和轻链之间通过二硫键连接，靶细胞表面标志分子的抗体重链和轻链之一与人IgG1Fc共价连接；并且A部分的效应细胞表面触发分子的抗体片段通过二硫键与B部分连接，A部分的人IgG1Fc通过盐桥和隆突-入-穴结构与B部分的人IgG1Fc连接；

所述的抗-HER2重链在223位点上的半胱氨酸与抗-HER2的轻链214位点上的半胱氨酸以二硫键的形式连接，所述抗-HER2重链在229和232位点上的半胱氨酸与抗-mCD3ScFv-Fc的254和257位点上的半胱氨酸分别以二硫键的形式连接，所述抗-HER2重链在368,399,407位点上与抗-mCD3ScFv-Fc的366,392,409位点上形成盐桥连接；

所述双特异性抗体的结构如图2所示。

2.制备权利要求1所述双特异性抗体的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)分别将B部分的重、轻链分别构建到第一表达载体上，将A部分构建到第二表达载体上，所述第一表达载体是pCHO1.0，第二表达载体是pCDNA3.4；

(2)将第一和第二表达载体一起共转染到细胞中，培养并取上清，所述细胞是CHO-S细胞；

(3)将上清分离得到纯化后的双特异性抗体；所述分离步骤包括：蛋白A亲和层析柱从上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，通过SP阳离子交换层析实现目标双特异性抗体与副产物的分离，再过Q柱，最后浓缩置换Buffer PBS。

3.权利要求2所述方法，其特征在于，所述方法的步骤(1)包括：

通过正向引物M802-VL F1与反向引物hIgK Pac ⅠR扩增抗-HER2轻链，再通过正向引物Kozak EcoR Ⅴ F与反向引物hIgK Pac Ⅰ RPCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点EcoR Ⅴ与Pac Ⅰ引入轻链；

通过正向引物M802-VH F1与反向引物hIgG1 Sbf Ⅰ R扩增抗-HER2重链，再通过正向引物Kozak Avr II F与反向引物hIgG1 Sbf Ⅰ R PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点Avr Ⅱ与BstZl7 Ⅰ引入重链；

将扩增好的轻链基因片段与用EcoR Ⅴ与Pac Ⅰ酶切过的pCHO1.0表达载体进行同源重组，获得装入抗-HER2轻链的表达载体；

然后用Avr Ⅱ与BstZl7 Ⅰ酶切后再和重链进行同源重组，获得抗-HER2的pCHO1.0表达载体，质粒命名为pCHO1.0-抗-HER2-HL-KKW；

通过正向引物hIgG1-Fc-F与反向引物hIgG1-CH 7His.Nhe Ⅰ-R pCDNA3.4 7His.NheⅠ-R两轮PCR扩增Fc结构域，通过正向Kozak Afl Ⅱ F与反向引物AMC3-1-VL-R1扩增抗-mCD3ScFv结构域，再通过正向引物hIgG1-FC F与反向引物pCDNA3.4 7His.Nhe Ⅰ-R/pCDNA3.4 7His.Nhe Ⅰ-R Overlap PCR扩增将Kozak序列、前导序列及酶切位点Afl Ⅱ与Nhe Ⅰ引入ScFv或Fc，将扩增好的2个基因片段与酶切过的pCDNA3.4表达载体进行同源重组，获得装入抗-mCD3ScFv-Fc的pCDNA3.4表达载体，质粒命名为pCDNA3.4-抗-mCD3ScFv-Fc-LDY。

4.权利要求1所述双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗HER2特异抗原表达所引起的肿瘤疾病或者用于杀死表达HER2的细胞。

5.权利要求1所述双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于在鼠肿瘤细胞系中筛选用于治疗表达HER2特异抗原的肿瘤细胞疾病的药物或者评价用于治疗表达HER2特异抗原的肿瘤细胞疾病的药物的药效。