[发明专利]一种检测EGFR基因突变的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因检测领域，涉及医学诊断和生物技术，具体涉及一种检测EGFR基因突变的试剂盒及其应用。

背景技术

表皮生长因子受体家族(EGFR)属于酪氨酸激酶受体家族，其介导的信号转导途径调节细胞的生长、增殖和分化。在癌症中发现EGFR酪氨酸激酶区常发生各种突变，这些突变和酪氨酸激酶抑制剂的疗效密切相关。因此，EGFR基因突变的检测对癌症的个体化治疗具有重要的参考价值。

EGFR家族由四个成员组成，分别是erbB1(EGFR/HER1)，erbB2(neu/HER2)，erbB3(HER3)，erbB4(HER4)。EGFR家族成员结构相似，包括胞外区、跨膜区、胞内区三部分。正常情况下，EGFR胞外区与相应配体结合，受体二聚化，形成同源二聚体或与其他家族成员形成异源二聚体。受体二聚化后构象发生改变与ATP分子结合，激活胞内的酪氨酸激酶活性，导致自身磷酸化，启动下游信号转导通路。EGFR的主要信号转导途径有：RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路，PI3K-PDK通路，PLC-γ通路，JAK-STAT通路(Cao C,Lu S,Sowa A,et al.Priming with EGFR tyrosine kinase inhibitor and EGF sensitizes ovarian cancer cells to respond to chemotherapeutical drugs[J].Cancer Letters.266(2):249-262)。通过这些途径，将胞外信号转化为胞内信号，从而有效应对外界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。

EGFR基因位于第七号染色体短臂上(7p12)，长约118kb，由28个外显子组成。其转录形成的mRNA长约5.6kb，编码的EGFR是分子量为170kD的跨膜糖蛋白，编码蛋白由1186个氨基酸组成，具有酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)活性，是传递胞外信号到胞内的重要途经蛋白。

EGFR酪氨酸激酶功能区由外显子18-24编码。其中外显子18-20编码N-lobe，外显子21-24编码C-lobe。EGFR的突变主要发生在胞内TK区域的前四个外显子上(18-21)，目前发现的TK区域突变有30多种(Sharma S V,Bell D W,Settleman J,et a1.Epidermal growthfactor receptor mutations in lung cancer[J].Nat Rev Cancer.7(3):169-181)。突变类型主要有三种：缺失突变、点突变、复制或插入突变。缺失突变主要发生在外显子19上，最常见的是delE746-A750，点突变最常见的是发生在外显子21上的L858R，复制或插入突变发生在外显子20上。其中外显子19的缺失突变(del E746-A750)和外显子21上的点突变(L858R)又叫经典突变或热点突变，约占突变的90％。具体阐述如下：

1.外显子19碱基缺失。主要是第746-752位密码子的碱基缺失突变，导致EGFR蛋白中氨基酸(ELREATS)序列丢失，这一缺失改变了受体ATP结合囊(ATP-binding pocket，ABP)的角度，从而显著增强癌细胞对Gefitinib的敏感性(Sordella R,Bell DW,Haber DA,Settleman J.Gefitinib-sensitizing EGFR mutations in lung cancer activate anti-apoptotic pathways.Science.305(5687):1163-7；Kosaka T,Yatabe Y,Endoh H,Kuwano H,Takahashi T,Mitsudomi T.Mutations of the epidermal growth factor receptor gene in lung cancer:biological and clinical implications.Cancer Res.64(24):8919-23)。

2.外显子21的点突变。主要是第858位密码子出现T→G转换，引起EGFR蛋白中该位点的氨基酸由亮氨酸转变为精氨酸(简称L858R),此突变位于DFG序列附近,其作用是使A-loop的稳定性提高,癌细胞对Gefitinib和Erlotinib的敏感性明显增强。