[发明专利]一种双特异性抗体HER2XCD3的构建及应用

权利要求书

1.双特异性抗体，其特征在于，所述抗体包含：(a)单价单元，为轻链-重链对，该轻链-重链对针对免疫细胞表面抗原CD3具有特异性结合能力；和(b)单链单元，为融合肽，该融合肽包含单链可变片段Scfv和具有铰链区、CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，其中该融合肽针对肿瘤细胞表面HER2抗原具有特异性结合能力；

其中，单链单元包括针对HER2的抗体抗-HER2，单价单元包括针对CD3的抗体抗-CD3；并且

所述抗-CD3重链的氨基酸序列为序列号1所示的氨基酸序列，抗-CD3的轻链氨基酸序列为序列号3所示的氨基酸序列，以及所述抗-HER2Scfv-Fc的氨基酸序列为序列号5所示的氨基酸序列；并且抗-CD3重链在222位点上的半胱氨酸与抗-CD3的轻链212位点上的半胱氨酸以二硫键的形式连接，所述的抗-CD3重链在228和231位点上的半胱氨酸与抗-HER2Scfv-Fc的258和261位点上的半胱氨酸分别以二硫键的形式连接，所述的抗-CD3重链在370和401位点上与抗-HER2Scfv-Fc的441和424位点上形成盐桥连接，所述的抗-CD3重链在409位点上与抗-HER2Scfv-Fc的398位点上形成隆突-入-穴连接。

2.制备权利要求1所述双特异性抗体的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)分别将单价单元的重、轻链分别构建到第一表达载体上，将单链单元构建到第二表达载体上，所述第一表达载体是pCHO1.0；所述第二表达载体是pCHO1.0-潮霉素；

(2)将第一和第二表达载体一起共转染到细胞中，培养并取上清，所述细胞是CHO-S细胞；

(3)将表达上清分离得到纯化后的双特异性抗体；所述分离步骤包括：蛋白A亲和层析柱从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，通过SP阳离子交换层析实现目标双特异性抗体与副产物的分离，再过Q柱，最后浓缩置换缓冲液PBS。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述方法的步骤(1)中：

所述单价单元为抗-CD3抗体，所述单价单元为抗-CD3抗体，扩增其轻链所用引物为Kozak(EcoR V)F、MK-Leader(EcoRV)F和hIgK(PacI)R，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点EcoR V与PacI引入轻链；扩增其重链所用引物为Kozak(Avr II)F、MK-Leader(AvrII)F和hIgG11(BstZ17I)R，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入重链；将扩增好的LC基因片段与用EcoR V与PacI酶切过的pCHO1.0表达载体进行同源重组，获得装入抗CD3轻链的表达载体；然后用AvrII与BstZl7I酶切后再和HC进行同源重组，获得抗CD3的pCHO1.0表达载体，质粒命名为pCHO1.0-L2K-HL-KKW；所述引物Kozak(EcoRV)F、MK-Leader(EcoRV)F、hIgK(PacI)R、Kozak(Avr II)F、MK-Leader(AvrII)F、hIgG11(BstZ17I)R核苷酸序列分别为SEQIDNO:9、10、11、12、13、14；

所述单链单元为抗-HER2ScFv-Fc抗体，扩增其所用引物为Kozak(AvrII)F、MK-Leader(AvrII)F、L2K-VH(MK)F1和hIgG11(BstZ17I)R，通过PCR扩增抗HER2ScFv-Fc结构域，并将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入ScFv-Fc，将扩增好的基因片段与酶切过的pCHO1.0-潮霉素表达载体进行同源重组，获得装入抗HER2Scfv-Fc的表达载体，质粒命名为pCHO1.0-潮霉素-赫赛汀-ScFv-Fc-LDY；其中，所述引物Kozak(AvrII)F、MK-Leader(AvrII)F、L2K-VH(MK)F1、hIgG11(BstZ17I)R核苷酸序列分别为SEQIDNO:15、16、17、18。

4.权利要求1所述双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗HER2特异抗原表达所引起的肿瘤疾病，或者用于杀死表达HER2的细胞。

5.权利要求1所述双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于在肿瘤细胞系中筛选用于治疗表达HER2特异抗原的肿瘤疾病的药物或者评价用于治疗表达HER2特异抗原的肿瘤疾病的药物的药效。