[发明专利]一种双特异性抗体HER2XCD3的构建及应用

权利要求书

1.双特异性抗体，其特征在于，所述抗体包含：(a)单价单元，为轻链-重链对，轻链为序列号3所示的氨基酸序列，重链为序列号1所示的氨基酸序列，该轻链-重链对针对肿瘤细胞表面抗原HER2具有特异性结合能力；和(b)单链单元，为融合肽，该融合肽为序列号5所示的氨基酸序列，其中该融合肽针对免疫细胞表面抗原CD3具有特异性结合能力；

单链单元包含单链可变片段ScFv和具有铰链区、CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，其中CH2结构域位于铰链区和CH3结构域之间,不包含CH1结构域,单链单元的铰链区位于ScFv和CH2结构域之间；所述单链可变片段由轻链可变区和重链可变区结构域通过连接肽连接组成；

抗-HER2重链在223位点上的半胱氨酸与抗-HER2的轻链214位点上的半胱氨酸以二硫键的形式连接，所述的抗-HER2重链在229和232位点上的半胱氨酸与抗-CD3 ScFv-Fc的255和258位点上的半胱氨酸分别以二硫键的形式连接，所述的抗-HER2重链在395和412位点上与抗-CD3 ScFv-Fc的428和397位点上形成盐桥连接，所述的抗-HER2重链在369位点上与抗-CD3 ScFv-Fc的436位点上形成隆突-入-穴连接。

2.制备权利要求1所述的双特异性抗体的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(1)分别将单价单元的重、轻链分别构建到第一表达载体上，将单链单元构建到第二表达载体上；

(2)将第一和第二表达载体一起共转染到CHO-S细胞中，培养并取上清；

(3)将表达上清分离得到纯化后的双特异性抗体；所述的分离步骤包括：蛋白A亲和层析柱从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，通过SP阳离子交换层析实现目标双特异性抗体与副产物的分离，再过Q柱，最后浓缩置换缓冲液PBS。

3.根据权利要求2所述的方法，所述的第一表达载体是pCHO1.0；所述的第二表达载体是pCHO1.0-潮霉素。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的方法的步骤(1)中：所述单价单元为抗-HER2抗体，扩增其轻链所用引物为Kozak EcoRV F、MK-leader EcoRV F和hIgK PacI R，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、MK-leader及酶切位点EcoRV与PacI引入轻链；扩增其重链所用引物为Kozak AvrII F、MK-leader AvrII F和hIgG1 BstZ17I R，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、MK-leader及酶切位点AvrII与BstZl7I引入重链；将扩增好的轻链基因片段与用EcoRV与PacI酶切过的pCHO1.0表达载体进行同源重组，获得装入抗-HER2轻链的表达载体；然后用AvrII与BstZl7I酶切后再和重链进行同源重组，获得抗HER2的pCHO1.0表达载体，质粒命名为pCHO1.0--赫赛汀-HL-KKW；

所述单链单元为抗-CD3 ScFv-Fc抗体，扩增其所用引物为Kozak AvrIIF、MK-leaderAvrII F、L2K-VH MK F1和hIgG1 BstZ17I R，通过重叠PCR扩增抗CD3 ScFv-Fc结构域，并将Kozak序列、MK-leader及酶切位点AvrII与BstZl7I引入ScFv-Fc，将扩增好的基因片段与酶切过的pCHO1.0-潮霉素表达载体进行同源重组，获得装入抗CD3ScFv-Fc的表达载体，质粒命名为pCHO1.0-潮霉素-L2K-ScFv-Fc-LDY。

5.权利要求1所述的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗HER2特异抗原表达所引起的肿瘤疾病，或者用于杀死表达HER2的细胞。

6.权利要求1所述的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于在肿瘤细胞系中筛选治疗表达HER2特异抗原的肿瘤细胞疾病的药物或者评价治疗表达HER2特异抗原的肿瘤细胞疾病的药物的药效。