[发明专利]一种基于水凝胶微孔板的细胞球原位制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及细胞球的制备方法，具体涉及一种基于水凝胶微孔板的细胞球原位制备方法。

背景技术

细胞球是一种多细胞聚集体，与二维细胞培养体系相比，细胞球培养能够更好地模拟在体微环境，获得与在体更为相近的响应结果，因此，在病理机理、药物筛选以及组织工程中具有广阔的应用前景。构建细胞球有多种方法，如基于细胞非粘附表面的微孔板法、基于重力的悬挂液滴法、基于磁力的磁悬浮法以及基于离心力的旋转培养法等。其中，微孔板法因其操作简单、可控性好、实现起来较为容易，得到了广泛的应用。

微孔板法的基本原理是利用微孔结构的空间约束和微孔板材料的细胞非粘附特性，促进细胞在生长过程中通过细胞之间的粘附力聚集成球。制备微孔板常用的材料是聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)，PDMS是目前微流控芯片领域用的最多的材料，成本低、惰性好、具有疏水性、无毒。制备PDMS微孔板常用的是模具法。模具材料通常采用硅或金属材料。但是硅和金属模具加工过程较为复杂，成本也较高，并且每次使用后清洗困难，重复使用效果差。

水凝胶是一种含有大量水的高分子聚合物网络，因其生物相容性、可降解性以及与细胞外基质相似等特性，在组织工程和再生医学领域得到了广泛的应用。近些年来，基于琼脂糖、海藻酸盐以及聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)水凝胶的微孔板在细胞球培养方面也得到了发展。目前水凝胶微孔板中微孔结构多半是圆柱状，底面是平的，形成的细胞球的尺寸和形状差异较大。最近研究表明，凹状微孔(如球面微孔)能够更好地促进细胞聚集生长后形成尺寸均一、形状规则的细胞球。但是，目前缺少一种有效的在水凝胶表面构建球面微孔的方法；并且，目前研究都是在构建微孔板后再人为种植细胞，存在效率低、种植细胞密度不均匀以及培养成球过程中细胞容易流失等问题。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种基于水凝胶微孔板的细胞球原位制备方法，该方法操作简单、成本低、适用范围广、成形效果好。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于水凝胶微孔板的细胞球原位制备方法，包括以下步骤：

1)将基片进行疏水处理，制得疏水基片；

2)将培养的细胞消化，然后与第一水凝胶溶胶混合，制成第一水凝胶溶胶细胞混合液；

其中，第一水凝胶溶胶为质量浓度3％～20％的明胶或甲基丙烯酸酰化明胶；

3)将第一水凝胶溶胶细胞混合液以0.05～2μL每液滴的形式沉积至步骤1)制得的疏水基片表面，形成半球状液滴，在0～20℃下静置至半球状液滴交联固化，制得载细胞的微尺度水凝胶模板；

4)在载细胞的微尺度水凝胶模板上方覆盖第二水凝胶溶胶，然后通过低温处理或紫外照射使第二水凝胶溶胶交联，形成第二水凝胶微孔板和载细胞的微尺度水凝胶模板复合结构；

其中，第二水凝胶溶胶为质量浓度1％～5％的琼脂糖，或者为质量浓度5％～20％的聚乙二醇水凝胶及聚乙二醇水凝胶衍生物；

5)将第二水凝胶微孔板和载细胞的微尺度水凝胶模板复合结构置于培养皿中，加入培养液后进行培养，直至第一水凝胶融化为溶胶，在此培养过程中，细胞在第二水凝胶微孔板的微孔中生长，形成细胞球。

步骤1)所述疏水处理具体为：

将基片浸泡在疏水剂中处理后，烘干；所述疏水剂为子西莱自清洁剂；

或者，将基片进行硅烷化处理；

或者，将聚四氟乙烯薄膜贴在基片上，制得疏水表面。

所述基片为玻璃基片或聚甲基丙烯酸甲酯基片。

步骤3)是采用移液枪、注射器或细胞打印平台将步骤2)得到的第一水凝胶溶胶细胞混合液沉积到步骤1)制备的疏水基片表面形成半球状液滴。

步骤3)所述的静置时间为10～60min。

步骤4)所述的低温处理是在0～20℃下静置5～30min。

步骤4)所述的紫外照射处理时间为10～120s。

步骤5)所述的培养是将加入培养液的培养皿置于37℃、二氧化碳浓度为5％的培养箱中进行培养1～14d。

步骤2)所述的培养的细胞为乳腺癌细胞MCF–7、造骨细胞、骨髓基质细胞、肝细胞、成纤维细胞、心肌细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、脂肪干细胞或神经前体细胞。

步骤2)所述的第一水凝胶溶胶细胞混合液中细胞浓度为0.01×10⁷～5×10⁷个/mL。