[发明专利]重组后不产生移码突变的载体、在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法及应用

说明书

本发明提供了一种重组后不产生移码突变的载体、在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法及应用。该方法包含以下步骤:1)使爪蛙受精卵中含有向导RNA、Cas9核酸酶以及带有胰腺ela‑荧光筛选标签和Cas9靶标片段的供体载体，2)在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，爪蛙基因组中目的基因中以及供体载体上的双链Cas9靶标片段被剪切，3)通过爪蛙细胞的自身DNA修复功能，实现在爪蛙基因组中的基因定点敲入；4)G0代胚胎通过胰腺ela‑荧光标签进行筛选，并对F1进行southern blot鉴定。本发明为利用爪蛙为模式动物研究遗传学和研究人类疾病奠定基础。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组后不产生移码突变的载体、在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法及应用。

背景技术

非洲爪蛙(Xenopus laevis)是一种早期胚胎学研究的经典模式动物。有胚胎个体大，产卵量多等优点。热带爪蛙(Xenopus tropicalis)具备非洲爪蛙的全部优点，另外该物种个体较小，繁殖周期短(4-5个月)，并且是二倍体品种，适合做遗传学研究。

热带爪蛙全基因组测序已完成，其基因组有约17亿个碱基对，包含2万至2.1万个基因，其中约1700个基因与人类相应的基因非常相似，所有人类基因中近80％的与遗传性疾病有关的基因都可在热带爪蟾的基因中找到对应处(Hellsten et al.，2010)。而这些基因与癌症、哮喘、心脏病等疾病的发病有关。所以，热带爪蛙是一个很好的研究基因功能，寻找疾病相关因子，建立遗传疾病，建立大规模药物筛选的理想模型。

以前，爪蛙通过mRNA注射达到基因过表达的目的，用morpholino注射达到基因敲降的目的。但是这两种方法都具有时效性，不能长期做遗传学研究。

20世纪末期，科学家用基因同源重组技术完成了基因敲除与定点修饰，这种方法由于效率极低(Thomas et al.，1987)，对生命科学的研究帮助仅局限于有胚胎干细胞与体细胞核移植技术成熟的物种。随着人们对生物学的进一步了解，发现DNA双链断裂可以有效的提高基因定点修饰的效率(Jasin.，1996)，基于此，近年来，随着能造成基因组定点双链断裂的工具，如ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9等的不断兴起，目前已成功地在多种物种的胚胎水平进行基因敲除与基因定点修饰。

利用基因打靶技术(ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9)在热带爪蛙和非洲爪蛙中，通过基因双链断裂后的非同源末端修复，造成移码突变，达到特定基因功能缺失的目的，实现了基因的定点破坏(Young et al.，2011；Lei et al.，2012；Ishibashi et al.，2012；Nakayamaet al.，2013；Blitz et al.，2013；Guo et al.，2014)，使得爪蛙在探索生物机制与生物医药中的作用大大增加。但是，在研究中，仅仅特定基因功能缺失存在很大的局限性，在大多数研究中，我们需要进行基因的时空表达调节与标记，定点突变相关因子建立人类疾病模型等。这时，我们需要对内源基因的某些位点进行精确的定点修饰与编辑。所以，在爪蛙中实现基于重组的基因定点修饰是非常重要的。

目前，在基因定点敲入修饰中，出现的各种技术主要可以分为两类。

1.由同源重组机制介导的基因定点修饰。这种技术通过模板的不同主要分为双链质粒模板，线性化质粒模板，单链模板介导的同源重组介导的基因定点修饰。

其缺点是：对同源臂要求高，效率低，并且繁琐。

2.由非同源末端连接机制介导的基因定点修饰。这种技术最近兴起，分别在细胞水平，模式动物斑马鱼中完成了基因定点修饰。但在斑马鱼中存在不在读码框内的现象(Auer et al.，2014)，使得效率降低2/3。