[发明专利]杂交瘤细胞AFB1‑2A4及其产生的黄曲霉毒素B1单克隆抗体

说明书

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株AFB1-2A4及其产生的黄曲霉毒素B1单克隆抗体。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxin，AF)是一种极强的剧毒物质，已被世界卫生组织的癌症研究机构划定为1类致癌物。黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株的代谢产物，普遍存在于霉变的粮食、饲料及其制品中。黄曲霉毒素B1、B2、G1及G2是粮食和食品中黄曲霉毒素主要存在形式，其中黄曲霉毒素B1的毒性和致癌性最强。黄曲霉毒素B1进入人体后，其主要靶器官为肝脏，急性中毒症状为恶心、呕吐、胃肠大出血而死亡。慢性中毒主要会引起肝癌，还可以诱发骨癌、肾癌、直肠癌等。

目前，检测黄曲霉毒素常用的仪器方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、微柱层析法。这些方法测定的准确度较高，重复性较好，但往往需配备大型较昂贵的设备，费用高，对操作人员要求高，一般适于在国家或地区级研究所或科研单位大型实验室中应用。酶联免疫法集合了抗原抗体反应的高特异性与酶促反应的高度敏感性。这种方法灵敏度高，比薄层法提高了近200倍；特异性强，荧光物质、色素、结构类似物对结果无干扰；而且回收率高，提取方法简单，可进行定性定量测定。要研究建立针对黄曲霉毒素B1(AFB1)的任何一种免疫学检测技术，都必须先获得抗黄曲霉毒素B1(AFB1)的抗体。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株AFB1-2A4及其产生的黄曲霉毒素B1(AFB1)的单克隆抗体

本发明提供了杂交瘤细株AFB1-2A4，该细胞株已于2014年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是，中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.10200，分类命名为S/P20杂交瘤细胞。

抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.10200的杂交瘤细胞株AFB1-2A4分泌产生。该AFB1单克隆抗体可以识别黄曲霉毒素B1，对黄曲霉毒素B1的50％抑制浓度IC50为33.2pg/mL。

抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体在黄曲霉毒素B1测定中的应用。

本发明提供的杂交瘤细胞株AFB1-2A4单克隆抗体是采用三步法筛选获得的，其具体步骤是：以AFB1在羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)作用生成AFB1肟，在EDC和NHS存在的条件下和BSA偶联生成AFB1-BSA。用其免疫BLAB/c小鼠4次，最后一次加强免疫用2倍与前一次免疫剂量的AFB1-BSA，免疫3天后进行细胞融合。采用ELISA分两步法进行筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出仅能抗黄曲霉毒素B1而不抗载体蛋白BSA的阳性克隆；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性克隆培养液进行检测，采用AFB1作为竞争源，选择吸光度值低、灵敏度较高的阳性克隆进行有限稀释法继续克隆，克隆10天后采用同样的两步筛选法进行抗体检测，如此重复2次，最终筛选获得的杂交瘤细胞AFB1-2A4。

本发明提供的黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将获得的杂交瘤细胞株AFB1-2A4注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体。

上述纯化方法的具体操作为：腹水于4℃，3000r/min离心5min以上，吸取上清，将上清与2倍体积的醋酸盐缓冲液混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合30min，4℃静置2h以上，使其充分沉淀。然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用砂芯漏斗过滤后，加入1/10滤液体积的0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.4，4℃预冷1小时，缓慢加入0.277g/mL硫酸铵至硫酸铵终浓度为45％，4℃静置2h以上，然后4℃ 12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析，将充分透析好的蛋白溶液加入等体积甘油，置-20℃冰箱中备用；

醋酸盐缓冲液：0.29g醋酸钠加入0.141mL醋酸，纯水定容至100mL；

0.1mol/L磷酸盐缓冲液：0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL。

0.01mol/L磷酸盐缓冲液：用纯水将0.1mol/L磷酸盐缓冲液稀释10倍。