[发明专利]一种可改善细菌灭活疫苗免疫效力的工艺

说明书

本发明涉及一种可改善细菌灭活疫苗免疫效力的工艺，其通过将生产用种子菌菌体经过离心收集、洗涤、机械破碎、制粒等工艺。应用该工艺制备的微粒抗原大大简化了细菌灭活疫苗生产流程，可使细菌灭活疫苗具备同时激活体液免疫和细胞免疫的能力，同时该工艺扩大了疫苗佐剂可选择范围；该工艺的应用可大幅降低菌体抗原使用浓度和缩短生产时间，从而降低疫苗生产成本；该工艺使疫苗制备免于使用甲醛等化学灭活剂，消除了有害化学物质的食品残留等隐患。

技术领域

本发明涉及到生物医药技术领域，具体涉及一种可改善细菌灭活疫苗免疫效力的工艺。

背景技术

作为一种对动物群体疫病的有效控制手段，动物疫苗技术优化和新型动物疫苗技术开发得到世界各国相关研究机构的重视。细菌灭活疫苗是先对筛选的细菌进行人工培养，然后用化学灭活剂(甲醛)将其灭活，最后与佐剂进行疫苗配制。目前我国使用的兽用细菌灭活疫苗有猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗、猪链球菌灭活疫苗、仔猪产气荚膜梭菌、禽多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗、副猪嗜血杆菌病灭活苗和猪萎缩性鼻炎灭活疫苗等。按照传统方法制备的细菌灭活疫苗通常只引发体液免疫，对细胞免疫系统无激发作用；由细菌灭活疫苗引起的免疫反应抗体滴度下降较快，需多次接种后才能产生保护性免疫；此外，传统的细菌灭活疫苗一直存在甲醛残留的隐患。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可改善细菌灭活疫苗免疫效力的工艺。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种可改善细菌灭活疫苗免疫效力的工艺，其依次包括如下步骤：

a.取种子菌，然后将种子菌进行发酵培养，发酵培养结束后，离心收集培养基中的菌体，所述离心处理的相对离心力为6000-8000xg、离心时间为10-20min；

b.将经过a步骤收集到的菌体重悬于生理盐水中，所述生理盐水的体积为经过a步骤得到的菌体湿重的50～100倍体积(W︰V)，接着进行搅拌使菌体均匀分散在生理盐水中；接着离心收集菌体，所述离心处理的相对离心力为6000-8000xg、离心时间为10-20min；

c.将b步骤收集到的菌体重悬于200～500倍体积(W︰V)的生理盐水中，得到菌液，所述菌液中菌体的浓度为1×1010CFU/mL，接着充分搅拌至均匀分散；

d.将c步骤获得的菌液加入无菌的低温超高压均质机/低温纳米级微生物破碎机的上样容器中，在2～8℃、300～700bar的压力下进行菌体破碎，重复三次，得到菌体裂解液；接着对菌体裂解液进行无菌检验；

e.取经过d步骤中进行无菌检验合格(该处的无菌检验合格是指菌体裂解液中无生物活性的细菌)的菌体裂解液，在低温超高压均质机/低温纳米级微生物破碎机进行制粒，制粒工作压力为1000～1200bar、温度为2～8℃，重复三次，得到菌体裂解悬液；

f.将经过e步骤得到的菌体裂解悬液用生理盐水或PBS调整为4×109～8×109CFU/mL。

本发明中，优选的方案为还包括步骤g.按照疫苗制备要求对f步骤得到菌体裂解液(即疫苗抗原)进行无菌检验等；检验合格后，按照佐剂乳化说明对制备的抗原进行乳化，疫苗制备好之后，按照《中国兽药典》附录方法对疫苗进行质量检验。

本发明中，优选的方案为所述e步骤中的制粒工艺制得的微粒粒径为20-500nm。

本发明中，优选的方案为所述d步骤的无菌检验操作具体为：在超净工作台中，将菌体裂解液划线接种到种子菌适宜生长的培养基中，在种子菌适宜生长的温度下培养12-24h，观察是否有菌落生长，无菌落生长，则无菌检验合格，。